ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Untuk komponen kimia Industri Kimia, Defisiensi SPECC1L menyebabkan peningkatan stabilitas sambungan yang disambung dan berkurangnya pelepasan sel puncak saraf kranial.

Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.

ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Untuk Industri Kimia

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.adalah produsen terkemuka yang mengkhususkan diri dalam pipa baja tahan karat mulus, tabung anil terang, tabung melingkar mulus dll.Untuk memudahkan pelanggan, kami juga telah mengelas pipa dan tabung.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.memiliki peralatan produksi dan pengujian paling canggih.Kami benar-benar dapat memenuhi kebutuhan Anda.Menurut standar yang sangat ketat, tabung yang kami produksi selalu memiliki toleransi OD dan WT yang benar.Kontrol toleransi sangat ketat untuk menghasilkan standar.Produk kami selalu puas dengan pelanggan.Pelanggan yang membeli produk kami menciptakan lebih banyak keuntungan.
a) OD (Diameter Luar): 3,18 mm hingga 101,6 mm
b) WT (Ketebalan Dinding): 0,5 mm hingga 20 mm
c) Panjang: Sesuai dengan kebutuhan pelanggan
d) Standar : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 dll
e) Metode Proses : ERW, EFW dll

Slider menampilkan tiga artikel per slide.Gunakan tombol kembali dan berikutnya untuk menelusuri slide, atau tombol pengontrol slide di akhir untuk menelusuri setiap slide.
Sel puncak saraf kranial (CNCC) mengelupas lipatan saraf embrionik dan bermigrasi ke lengkung faring, yang membentuk sebagian besar struktur bagian tengah wajah.Disfungsi CNCC memainkan peran penting dalam etiologi celah orofasial, suatu kelainan bawaan yang umum.Mutasi SPECC1L heterozigot telah ditemukan pada pasien dengan celah atipikal dan sindromik.Di sini, kami melaporkan peningkatan pewarnaan komponen sambungan perekat kanonik (AJ), β-catenin dan E-cadherin dalam sel knockdown SPECC1L yang dikultur, dan mikrograf elektron menunjukkan difusi apikal-basal AJ.Untuk memahami peran SPECC1L dalam morfogenesis kraniofasial, kami membuat model tikus yang kekurangan Specc1l.Mutan homozigot mematikan embrio dan menunjukkan gangguan penutupan tabung saraf dan laminasi CNCC.Pewarnaan protein AJ meningkat pada lipatan saraf mutan.Cacat AJ ini konsisten dengan cacat pada delaminasi CNCC, yang memerlukan pembubaran AJ.Selain itu, mutan Specc11 telah mengurangi sinyal PI3K-AKT dan meningkatkan apoptosis.Secara in vitro, penghambatan ringan sinyal PI3K-AKT pada sel tipe liar sudah cukup untuk menginduksi perubahan AJ.Yang penting, perubahan AJ yang disebabkan oleh knockdown SPECC1L dapat dibalik dengan aktivasi jalur PI3K-AKT.Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa SPECC1L, sebagai pengatur baru pensinyalan PI3K-AKT dan biologi AJ, diperlukan untuk penutupan tabung saraf dan stratifikasi CNCC.
Sel puncak saraf kranial (CNCCs) terlokalisasi pada neuroektoderm dorsal dan terlepas dari neuroepitel lipatan saraf yang sedang berkembang melalui proses yang melibatkan transisi epitel-mesenkim (EMT)1,2,3.CNCC epitel yang bermigrasi mengganggu sambungan antar sel dan menjadi CNCC mesenkim yang bermigrasi yang mengisi lengkung faring pertama dan kedua dan membentuk sebagian besar tulang rawan kraniofasial.Oleh karena itu, gen yang mengatur fungsi CNCC sering kali terganggu dalam etiologi kelainan kongenital kraniofasial seperti celah orofasial, yang paling sering menyerang 1/800 kelahiran di AS saja.Salah satu kelainan bawaan8.
Delaminasi CNCC bertepatan dengan penutupan tabung saraf anterior antara 8,5 dan 9,5 hari perkembangan embrio pada tikus.Mutan dari sejumlah gen yang berhubungan dengan celah orofasial tikus juga menunjukkan beberapa bentuk cacat tabung saraf, termasuk Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, dan Pdgfrα12.Namun, proses penutupan tabung saraf dan stratifikasi CNCC dapat dianggap independen, karena tikus mutan Splotch (Pax3) menunjukkan cacat pada penutupan tabung saraf tanpa efek apa pun pada stratifikasi atau migrasi CNCC 13,14.Model tikus tambahan dengan cacat pada diseksi CNCC dan penutupan tabung saraf akan membantu menggambarkan dasar molekuler umum dari kedua proses ini.
Isolasi CNCC dari sel neuroepitel memerlukan pelarutan adhesive Junctions (AJs) yang tersusun dari kompleks protein yang antara lain mengandung E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, dan α-actinin yang berasosiasi dengan filamen aktin 2 Studi ekspresi berlebih E-cadherin pada lipatan saraf menunjukkan penurunan atau penundaan delaminasi CNCC.Sebaliknya, penindasan terhadap E-cadherin menghasilkan stratifikasi awal15,16.Banyak faktor yang memediasi EMT selama stratifikasi CNCC adalah faktor transkripsi (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) dan protein remodeling matriks ekstraseluler (ECM) seperti matriks metalloproteinases (MMPs), namun CNCC adalah regulator sitoskeletal AJ langsung. belum diketahui.Jalur PI3K-AKT diketahui memusuhi kadar E-cadherin, terutama dari penelitian kanker17.Penelitian terbaru menunjukkan bahwa hilangnya sinyal PI3K-AKT berbasis PDGFα pada tikus menyebabkan kelainan kraniofasial, termasuk celah langit-langit dan cacat tabung saraf12.Namun, hubungan antara jalur PI3K-AKT dan stabilitas AJ pada stratifikasi CNCC masih belum jelas.
Kami sebelumnya mengidentifikasi SPECC1L sebagai gen mutan pertama pada dua orang dengan celah parah yang memanjang dari mulut hingga mata, yang dikenal sebagai celah miring (ObFC) atau celah Tessier IV18.Mutasi SPECC1L telah diidentifikasi dalam dua keluarga multigenerasi dengan sindrom Opitz G/BBB autosomal dominan (OMIM #145410), di mana individu yang terkena dampak menunjukkan hiperdistensi dan bibir/langit-langit sumbing19, dan dalam satu keluarga dengan sindrom overdistance Tibi (OMIM #145420)20 .lebih dari separuh kasus sindrom Opitz G/BBB terkait dengan X (OMIM #300000) dan disebabkan oleh mutasi pada gen MID1, yang mengkode protein 22 kerangka sel terkait mikrotubulus.Kami berhipotesis bahwa SPECC1L, juga merupakan protein yang terkait dengan mikrotubulus dan sitoskeleton aktin, dapat memediasi sinyal yang diperlukan untuk remodeling sitoskeleton aktin selama adhesi dan migrasi sel 18 .Melalui penelitian in vitro dan in vivo, kami sekarang menggambarkan SPECC1L sebagai regulator baru stabilitas AJ melalui pensinyalan PI3K-AKT.Pada tingkat sel, defisiensi SPECC1L mengakibatkan penurunan kadar protein pan-AKT dan peningkatan dispersi apikal-basal AJ, yang dihilangkan dengan aktivasi kimiawi jalur AKT.Secara in vivo, embrio yang kekurangan Specc11 menunjukkan gangguan penutupan tabung saraf dan berkurangnya diseksi CNCC.Dengan demikian, fungsi SPECC1L dalam sinyal berbasis adhesi sel yang diatur secara ketat diperlukan untuk fungsi CNCC normal selama morfogenesis wajah.
Untuk mengkarakterisasi peran SPECC1L pada tingkat sel, kami menggunakan garis sel osteosarkoma stabil yang dijelaskan sebelumnya, kekurangan U2OS pada SPECC1L18.Sel-sel U2OS yang stabil dengan knockdown SPECC1L (kd) mengalami penurunan tingkat transkrip dan protein SPECC1L yang moderat (60-70%), bersamaan dengan cacat dalam migrasi dan reorganisasi sitoskeleton aktin 18. Sebaliknya, terjadi penurunan sementara yang parah pada sel-sel tersebut. SPECC1L telah terbukti menyebabkan cacat mitosis 23 .Setelah karakterisasi lebih lanjut, kami menemukan bahwa sel SPECC1L-kd kami yang stabil mengubah morfologi pada tingkat pertemuan yang sangat tinggi (Gambar 1).Sel kontrol individu dan sel kd pada pertemuan rendah tampak serupa (Gambar 1A,D).24 jam setelah fusi, sel kontrol mempertahankan bentuk kuboidnya (Gbr. 1B, E), sementara sel SPECC1L-kd memanjang (Gbr. 1C, F).Tingkat perubahan bentuk sel ini ditangkap oleh pencitraan langsung sel kontrol dan sel kd secara in vivo (film 1).Untuk menentukan peran SPECC1L dalam sel konfluen, pertama-tama kami memeriksa ekspresinya.Kami menemukan bahwa kadar protein SPECC1L meningkat pada saat fusi (Gambar 1G), sedangkan kadar transkrip SPECC1L tidak meningkat (Gambar 1H).Selain itu, ketika kepadatan sel meningkat, protein SPECC1L terakumulasi pada batas antar sel (Gambar 2A-E), dengan pola yang tumpang tindih dengan pola β-catenin yang terkait dengan membran (Gambar 2A'-E').Mengingat hubungan SPECC1L dengan sitoskeleton aktin 18,23 kami berhipotesis bahwa SPECC1L berinteraksi dengan sambungan perekat berbasis aktin (AJ).
(AF) Sel knockdown (DF) SPECC1L memanjang pada pertemuan tinggi (F) dibandingkan dengan sel kontrol U2OS (AC).Ditampilkan di sini adalah tiga dari enam titik waktu (T1, T3, T6) yang kami pilih untuk kepadatan sel yang berbeda.(G) Analisis Western blot menunjukkan bahwa protein SPECC1L distabilkan pada tingkat pertemuan yang tinggi dibandingkan dengan tingkat pertemuan yang rendah pada sel kontrol.Western blot pada SPECC1L menunjukkan pita 120 kDa yang diharapkan dan pita dengan berat molekul lebih tinggi, kemungkinan dimodifikasi pasca-translasi (*).Analisis Western blot dilakukan pada kondisi yang sama untuk pertemuan rendah dan tinggi.Gambar yang menunjukkan SPECC1L pada pertemuan rendah dan tinggi diambil dari noda yang sama.Noda yang sama telah dihilangkan dan diperiksa ulang dengan antibodi β-aktin.(H) Analisis RT-PCR kuantitatif menunjukkan tidak ada perubahan signifikan pada level transkrip SPECC1L.Bilah kesalahan mewakili SEM dari empat percobaan independen.
(AE) Kami memilih enam titik waktu (T1-T6) yang mewakili rentang kepadatan sel untuk menormalkan analisis bentuk sel dan perubahan AJ dalam sel U2OS dengan knockdown SPECC1L (kd).Lima titik waktu pertama termasuk sel tunggal (T1), fusi 50-70% kelompok sel kecil (T2), fusi tanpa membentuk kembali sel kd (T3), membentuk kembali sel kd (T4), dan perubahan 24 jam.dalam bentuk posterior sel kd (T5).Protein SPECC1L sebagian besar tersebar di sitoplasma pada T1 (A), tetapi akumulasinya diamati pada batas antar sel pada titik waktu berikutnya (B – E, panah).(FJ) β-catenin menunjukkan akumulasi serupa pada batas antar sel yang terkait dengan kompleks AJ.(A'-E') SPECC1L dan β-catenin menunjukkan pewarnaan yang tumpang tindih pada batas sel pada kepadatan sel yang tinggi (panah).(F'-J') Dalam sel SPECC1L-kd, pewarnaan β-catenin tampak normal pada kepadatan sel rendah (F'-H'), tetapi meluas seiring perubahan bentuk sel (I', J'; panah), menunjukkan bahwa AJ telah berubah.Batangan = 10 µm.
Kami kemudian mencoba untuk mengetahui pengaruh defisiensi SPECC1L pada AJ.Kami menggunakan beberapa penanda terkait AJ, termasuk komponen kanonik F-aktin, miosin IIb, β-catenin, dan E-cadherin24,25,26,27.Serat stres aktin meningkat pada sel SPECC1L-kd seperti dijelaskan sebelumnya (Gambar 3A,B) 18 .Myosin IIb yang terkait dengan filamen aktin menunjukkan peningkatan serupa pada sel SPECC1L-kd in vitro (Gambar 3C,D).β-catenin yang terkait dengan AJ berikatan dengan cadherin di membran sel, menunjukkan pola ekspresi “sarang lebah” yang normal pada kubosit kontrol (Gbr. 3E, G).Menariknya, dalam gambar datar menggunakan mikroskop confocal, pewarnaan β-catenin (Gambar 3E,F) dan E-cadherin (Gambar 3G,H) pada membran sel sel-sel yang kekurangan SPECC1L yang konfluen menunjukkan pola pewarnaan yang diperluas.Perluasan pewarnaan β-catenin terkait AJ dalam sel kd paling menonjol pada pertemuan, tetapi tampaknya mendahului perubahan bentuk sel (Gambar 2F-J, F'-J').Untuk menentukan sifat fisik dari pewarnaan AJ yang diperluas ini, kami memeriksa batas sel pada permukaan apikal-basal sel SPECC1L-kd U2OS dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) (Gambar 3I,J).Berbeda dengan sel kontrol (Gambar 3I), yang memiliki daerah padat elektron terpisah yang menunjukkan AJ (panah), sel kd (Gambar 3J) menunjukkan daerah besar dan berdekatan dengan kepadatan elektron tinggi yang menunjukkan AJ di sepanjang bidang apicobasal..Selain itu, pada bagian melintang, kami mengamati lipatan membran sel yang luas pada sel kd (Gambar S1A,B), yang menjelaskan pola perluasan pita pewarnaan β-catenin dan E-cadherin (Gambar 3F,H).Untuk mendukung peran SPECC1L dalam AJs, β-catenin diimunopresipitasi bersama dengan SPECC1L dalam lisat sel U2OS yang konfluen (Gbr. 3K).Seiring dengan perluasan imunostaining untuk penanda AJ, analisis TEM konsisten dengan hipotesis kami bahwa defisiensi SPECC1L meningkatkan kepadatan dan varians apikal-basal AJ.
(AH) Peningkatan pewarnaan F-aktin pada sel kd pada 48 jam pasca fusi (T6; A, B).Perubahan pewarnaan miosin IIb terkait dengan F-aktin (C, D).Pola halus pewarnaan membran β-catenin dan E-cadherin dalam sel kontrol (E, G) ditingkatkan dalam sel SPECC1L-kd (F, H).Batangan = 10 µm.(I – J) Mikrograf elektron mengamati persimpangan antar sel apikal-basal.Sel kontrol menunjukkan daerah padat elektron yang berbeda yang menunjukkan sambungan lengket (I, panah).Sebaliknya, seluruh persimpangan apikal-basal dalam sel SPECC1L-kd tampak padat elektron (J, panah), menunjukkan peningkatan kepadatan dan dispersi sambungan perekat.(K) β-catenin diimunopresipitasi bersama dengan SPECC1L dalam lisat sel U2OS yang konfluen.Gambar diambil dari satu tempat yang mewakili salah satu dari empat percobaan independen.
Untuk memahami peran SPECC1L dalam morfogenesis kraniofasial, kami membuat model tikus yang kekurangan Specc1l menggunakan dua garis sel perangkap ES independen, DTM096 dan RRH048 (BayGenomics, CA), yang mewakili intron 1 dan transkrip Specc1l ditangkap pada 15 (Gbr. 1) .4A, gambar S2).Lokasi genom dari penyisipan vektor umpan ditentukan oleh sekuensing seluruh genom dan dikonfirmasi oleh PCR (Gbr. S2).Kedua desain perangkap gen juga memungkinkan fusi dalam bingkai reporter Specc11-lacZ saat ditangkap.Oleh karena itu, ekspresi lacZ yang ditentukan dengan pewarnaan X-gal digunakan sebagai indikator ekspresi Specc11.Kedua alel menunjukkan pola ekspresi lacZ yang serupa, dengan perangkap gen DTM096 di intron 1 menunjukkan ekspresi yang lebih kuat dibandingkan RRH048 di intron 15 (tidak diperlihatkan).Namun, Specc1l diekspresikan secara luas, dengan ekspresi yang sangat kuat pada lipatan saraf pada E8.5 (Gambar 4B), pada tabung saraf dan proses wajah pada E9.5 dan E10.5 (Gambar 4C,D), dan pada anggota tubuh yang sedang berkembang. di E10.5 dan mata (Gambar 4D).Kami sebelumnya melaporkan bahwa ekspresi SPECC1L pada lengkung faring pertama di E10.5 terdapat pada epitel dan mesenkim yang mendasarinya, konsisten dengan garis keturunan CNCC.Untuk menguji ekspresi SPECC1L di CNCC, kami melakukan lipatan saraf E8.5 (Gambar 4E-J) dan bagian tengkorak E9.5 (Gambar 4K-).Pada E8.5, SPECC1L menodai lipatan saraf secara intens (Gambar 4E, H), termasuk sel yang diwarnai dengan penanda NCC (Gambar 4G, J).Pada E9.5, SPECC1L (Gbr. 4K, N) dengan pewarnaan kuat CNCC migrasi yang diwarnai bersama dengan AP2A (Gbr. 4L, M) atau SOX10 (Gbr. 4O, P).
(A) Representasi skema gen Specc11 tikus yang menunjukkan penyisipan vektor umpan dalam klon sel ES DTM096 (intron 1) dan RRH048 (intron 15).(BD) pewarnaan lacZ dari embrio Specc1lDTM096 heterozigot yang mewakili ekspresi Specc1l dari E8.5 hingga E10.5.NE = neuroektoderm, NF = lipatan saraf, PA1 = lengkung faring pertama.(EP) Immunostaining SPECC1L dengan penanda NCC AP2A dan SOX10 pada lipatan saraf E8.5 (NF; EJ) dan bagian tengkorak E9.5 (KP).Pewarnaan SPECC1L diamati secara luas pada lipatan saraf E8.5 (E, H; mata panah), termasuk sel yang diberi label AP2A (F, G; mata panah) dan SOX10 (I, J; mata panah).Pada E9.5, SPECC1L sangat mewarnai CNCC yang bermigrasi (K, N; panah) berlabel AP2A (L, M; panah) dan SOX10 (O, P; panah).
Persilangan antara tikus heterozigot Specc1lDTM096/+ dan Specc1lRRH048/+ menunjukkan bahwa kedua alel perangkap gen tidak saling melengkapi dan bahwa senyawa heterozigot dan homozigot embrionik untuk salah satu alel perangkap gen bersifat mematikan embrio (Tabel S1).Rasio Mendel menunjukkan penurunan tingkat kelangsungan hidup heterozigot saat lahir (diperkirakan 1,34 vs. 2,0).Kami mencatat angka kematian perinatal yang rendah di antara heterozigot, beberapa memiliki anomali kraniofasial (Gambar S3).Namun, rendahnya penetrasi fenotip kraniofasial perinatal ini membuat sulit untuk mempelajari mekanisme patofisiologi yang mendasarinya.Oleh karena itu, kami fokus pada fenotip embrionik mematikan dari mutan Specc11 homozigot.
Sebagian besar embrio mutan Specc1lDTM096/RRH048 senyawa heterozigot atau homozigot tidak berkembang setelah E9.5–10.5 (Gambar 5A – D), dan tabung saraf tidak menutup di bagian anterior (Gambar 5B, D) dan terkadang tertutup di bagian posterior (tidak ditampilkan) ..Cacat penutupan tabung saraf kranial ini dikaitkan dengan sebagian besar DLX2 bertanda CNCC yang tersisa di lipatan saraf pada E10.5, menunjukkan tidak adanya diseksi (Gambar 5A'-D').Untuk menentukan apakah ukuran keseluruhan CNCC juga berkurang, kami menandai garis CNCC dengan GFP di garis perangkap gen kami dengan Wnt1-Cre dan ROSAmTmG.Kami mengalirkan GFP+ NCC dan GFP- (RFP+) non-NCC yang diurutkan dari seluruh embrio.Pada E9.5, proporsi CNCC berlabel GFP yang diurutkan aliran tidak berubah secara signifikan antara WT dan embrio mutan (tidak ditampilkan), menunjukkan spesifikasi CNCC normal.Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa sisa pewarnaan Wnt1-Cre dan DLX2 pada lipatan saraf yang terbuka (Gambar 5B') disebabkan oleh cacat lapisan CNCC, kemungkinan karena peningkatan kepadatan atau dispersi sel AJ, seperti yang terlihat pada sel SPECC1L-kd.Kami menggunakan penanda NCC SOX10, AP2A, dan DLX2 untuk mengkonfirmasi keberadaan CNCC di lipatan saraf (Gambar 5E-R).Pada E8.5, pewarnaan lipatan saraf untuk ketiga penanda NCC diamati pada bagian WT (Gambar 5E, G, I) dan mutan Specc1l (Gambar 5F, H, J).Pada E9.5, sementara penanda NCC menodai NCC yang bermigrasi di bagian WT (Gambar 5M, O, Q), sisa pewarnaan NCC diamati pada lipatan saraf yang terpapar dari embrio mutan Specc1l (Gambar 5N, P, R).Karena SOX10 dan DLX2 menandai CNCC yang bermigrasi, hasil ini menunjukkan bahwa CNCC yang kekurangan SPECC1L mencapai spesifikasi pasca-migrasi tetapi gagal untuk bermigrasi dari lipatan saraf.
Defisiensi Specc11 menyebabkan kerusakan penutupan tabung saraf, delaminasi sel puncak saraf kranial dan AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrio membawa sel krista saraf kranial yang bermigrasi (CNCC) berlabel Wnt1-Cre (A').Sebaliknya, embrio mutan Specc11 menunjukkan lipatan saraf terbuka (B', mata panah) dan CNCC yang belum bermigrasi (B', mata panah).(C, D') Gambar bidang terang (C, D') dan immunostaining (C', D') dari penanda CNCC DLX2 dari embrio E10.5 WT (C, C') dan Specc1l (D, D').Pada embrio WT E10.5, CNCC positif DLX2 mengkolonisasi lengkungan insang (C', panah), sedangkan pada mutan, pewarnaan yang mencolok tetap ada pada lipatan saraf terbuka (D', panah) dan pada lengkungan faring pertama (D', panah).) dengan beberapa pewarnaan (panah) yang menunjukkan delaminasi dan migrasi CNCC yang buruk.ER) Bagian embrio mutan WT dan Specc1l pada tahap E8.5 (E–L) dan E9.5 (M–R) diberi label dengan penanda NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) dan DLX2 (I, J, Q, R).Pada E8.5, pewarnaan NCC diamati pada lipatan saraf tipe liar (NF) dan bagian mutan.Pewarnaan bersama SOX10 dan β-catenin pada E8.5 WT (K) dan mutan (L) menunjukkan peningkatan pewarnaan β-catenin pada batas sel di lipatan saraf.Pada E9.5, pewarnaan tipe liar dari CNCC yang bermigrasi (M, O, Q) diamati, sedangkan pada mutan, CNCC yang tidak terstratifikasi menodai lipatan saraf terbuka (N, P, R).(S – Z) Analisis pelabelan AJ in vivo pada bagian koronal embrio WT dan Specc11DTM096/RRH048 dengan mutasi E9.5.Perkiraan bidang penampang ditampilkan di sudut kanan atas.Pada bagian jaringan mutan, peningkatan pewarnaan F-aktin (S, T) dan miosin IIb (U, V) diamati.Mirip dengan hasil in vitro pada Gambar 3, pada embrio mutan, peningkatan pewarnaan membran untuk β-catenin (W, X) dan E-cadherin (Y, Z) diamati.(AA-BB) Mikrograf elektron dari bagian embrio tipe liar yang melihat melampaui batas sel apikal-basal menunjukkan wilayah padat elektron yang berbeda yang menunjukkan sambungan perekat (AA, panah).Sebaliknya, pada bagian embrio mutan Specc11 (BB, panah), seluruh sambungan apicobasal padat elektron, menunjukkan peningkatan kepadatan dan dispersi sambungan perekat.
Untuk menguji hipotesis kami bahwa berkurangnya layering disebabkan oleh perubahan AJ, kami memeriksa pelabelan AJ pada lipatan saraf embrio mutan Specc1l yang terbuka (Gambar 5S-Z).Kami mengamati peningkatan serat stres aktin (Gambar 5S, T) dan peningkatan lokalisasi pewarnaan miosin IIB pada serat aktin (Gambar 5U, V).Yang penting, kami mengamati peningkatan pewarnaan β-catenin (Gambar 5W,X) dan E-cadherin (Gambar 5Y,Z) pada batas antar sel.Kami juga memeriksa pewarnaan β-catenin NCC pada lipatan saraf embrio E8.5 (Gambar 5K, L).Pewarnaan β-catenin tampaknya lebih kuat pada lipatan saraf mutan Specc1l (Gambar 5L dan K), menunjukkan bahwa perubahan AJ telah dimulai.Dalam mikrograf elektron bagian tengkorak embrio E9.5, kami kembali mengamati peningkatan pewarnaan padat elektron difus pada embrio mutan Specc1l dibandingkan dengan WT (Gambar 5AA, BB dan S1E-H).Secara keseluruhan, hasil ini mendukung hasil in vitro kami dalam sel SPECC1L-kd U2OS dan menunjukkan bahwa pewarnaan AJ yang menyimpang mendahului stratifikasi CNCC pada embrio mutan kami.
Mengingat hubungan antagonis yang diketahui antara aktivitas AKT dan stabilitas E-cadherin, kami berhipotesis tentang keterlibatan pensinyalan PI3K-AKT.Selain itu, kami mengamati lepuh subepidermal pada beberapa embrio mutan kami yang lolos dari kematian (<5%) pada E9.5-10.5 dan malah menetap di sekitar E13.5 (Gbr. S3).Vesikel subepidermal adalah ciri berkurangnya sinyal PI3K-AKT berdasarkan PDGFRα12.Fantauzzo dkk.(2014) melaporkan bahwa gangguan aktivasi PI3K berbasis PDGFRα pada embrio mutan PdgfraPI3K/PI3K menghasilkan vesikel subepidermal, cacat tabung saraf, dan fenotip langit-langit mulut sumbing.Memang, kadar pan-AKT dan Ser473-AKT terfosforilasi aktif berkurang secara in vivo pada jaringan mutan Specc1l menjadi penangkapan embrio E9.5 (Gambar 6A-D).Penurunan kadar Ser473-AKT terfosforilasi mungkin seluruhnya disebabkan oleh penurunan kadar pan-AKT in vivo (Gambar 6E) dan in vitro (Gambar 6F).Penurunan in vitro diamati hanya ketika sel-sel U2OS sangat menyatu dengan perubahan bentuk sel dan kepadatan AJ (Gambar 6D).Dengan demikian, data kami menunjukkan bahwa SPECC1L adalah regulator positif baru dari pensinyalan PI3K-AKT dalam morfogenesis kraniofasial.
(A–E) Bagian tengkorak E8.5 (A,B) dan E9.5 (C,D) atau lisat E9.5 dari embrio mutan Specc1l (E) menunjukkan tingkat reduksi protein S473-AKT dan pan-AKT terfosforilasi aktif , dibandingkan dengan kontrol WT.Western blotting dilakukan pada lisat tipe liar dan lisat mutan dalam kondisi yang sama.Gambar yang ditampilkan untuk SPECC1L diambil dari satu noda.Noda yang sama telah dihilangkan dan diperiksa ulang dengan antibodi anti-pan-ACT dan β-aktin.Tingkat Pan-AKT di lipatan saraf E8.5 (A, B) dan tingkat S473-AKT terfosforilasi di bagian tengkorak E9.5 berkurang secara signifikan.(F) Tingkat Pan-AKT juga berkurang pada lisat sel SPECC1L-kd U2OS yang dipanen pada pertemuan tinggi.Bilah kesalahan mewakili SEM dari tiga kuantifikasi Western blot independen.(GJ) Bagian embrio WT pada E9.5 masing-masing diwarnai dengan KI67 dan caspase 3 yang dibelah, menunjukkan proliferasi sel (G, G') dan sedikit aktivitas apoptosis (H, H').Embrio mutan Specc11 menunjukkan proliferasi sel yang sebanding (I), tetapi jumlah sel yang menjalani apoptosis meningkat secara signifikan (J).
Kami kemudian memeriksa penanda proliferasi dan apoptosis.Kami tidak mengamati adanya perbedaan dalam proliferasi embrio E9.5 (Gambar 6E, G dibandingkan dengan I) dengan indeks proliferasi 82,5% untuk mutan WT dan 86,5% untuk mutan Specc1l yang diukur dengan pewarnaan KI67 (p <0,56, Fisher's tes eksak).Demikian pula, kami tidak mengamati adanya perbedaan dalam apoptosis yang diukur dengan pewarnaan untuk caspase 3 yang terpecah pada lipatan saraf pada E8.5 hingga penghentian embrio (tidak diperlihatkan) (tidak diperlihatkan).Sebaliknya, apoptosis meningkat secara signifikan pada semua embrio mutan E9.5 (Gambar 6F, H dan J).Peningkatan apoptosis secara keseluruhan ini konsisten dengan berkurangnya sinyal PI3K-AKT dan kematian embrio dini29,30,31.
Selanjutnya, untuk mengkonfirmasi peran sebab akibat dari pensinyalan PI3K-AKT dalam perubahan AJ dalam sel kd kami, kami secara kimia mengubah jalur dalam sel kontrol dan sel kd (Gambar 7A-F).Kami menggunakan sebagai penanda fenotip perubahan bentuk sel yang diamati dalam sel SPECC1L-kd konfluen, yang kami ukur menggunakan rasio dimensi terpanjang (panjang) dengan dimensi vertikal (lebar) yang sesuai.Rasio 1 diharapkan untuk sel yang relatif bulat atau berbentuk kubus (Gambar 7G).Selain bentuk sel, kami juga mengkonfirmasi efeknya pada AJ dengan pewarnaan β-catenin (Gambar 7A'-F').Penghambatan jalur PI3K-AKT menggunakan wortmannin cukup untuk mengubah bentuk sel pada sel kontrol (Gambar 7A,C) dan AJ (Gambar 7A').Aktivator PI3K-AKT SC-79 tidak mempengaruhi bentuk sel (Gbr. 7A, E) atau ekspansi AJ (Gbr. 7A') pada sel kontrol.Dalam sel SPECC1L-kd, penekanan lebih lanjut pada jalur PI3K-AKT menghasilkan peningkatan apoptosis (Gambar 7B,D) dan peningkatan pewarnaan β-catenin (Gambar 7B'), konsisten dengan mutan berat in vivo kami.Yang penting, aktivasi jalur PI3K-AKT secara signifikan meningkatkan bentuk sel (Gambar 7B,F) dan fenotip AJ (Gambar 7B”).Perubahan bentuk sel diukur sebagai rasio kebulatan sel (CCR) dan dibandingkan signifikansinya seperti dijelaskan di atas (Gbr. 7G).Memang, dalam sel kontrol (Gambar 7G, CCR = 1,56), pengobatan wortmannin cukup untuk mengubah bentuk sel secara signifikan (Gambar 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) hingga tingkat yang mirip dengan yang diamati. di SPECC1L.-kd sel (Gbr. 7G, CCR = 3.46).Pengobatan wortmannin pada sel SPECC1L-kd (Gambar 7G, CCR = 3,60, dapat diabaikan) tidak lebih signifikan dibandingkan sel kd yang tidak diobati (Gambar 7G, CCR = 3,46, dapat diabaikan) atau sel kontrol yang diobati dengan wortmannin (Gambar 7G)., CCR = 3.46, dapat diabaikan) juga mempengaruhi pemanjangan sel (7G, CCR = 3.61, dapat diabaikan).Yang paling penting, aktivator SC-79 AKT mengembalikan fenotip sel SPECC1L-kd yang memanjang (Gbr. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Hasil ini mengkonfirmasi bahwa SPECC1L mengatur pensinyalan PI3K-AKT dan menunjukkan bahwa penurunan SPECC1L yang moderat mempengaruhi adhesi sel, sementara penurunan yang kuat menyebabkan apoptosis (Gbr. 8).
(A–F') Sel kontrol (A, C, E) dan SPECC1L-kd (B, D, F) diobati dengan penghambat jalur PI3K-AKT wortmannin (C, D) atau aktivator SC-79 (E, F) Perawatan .Sel kontrol yang tidak diberi perlakuan berbentuk kuboid (A) dengan pewarnaan seluler β-kucing normal (A'), sedangkan sel kd memanjang (B) dengan peningkatan pewarnaan β-kucing (B').Setelah penekanan jalur PI3K-AKT, sel kontrol memanjang (C) dengan ekspansi β-cat (C'), sementara sel kd mulai menjalani apoptosis (D), mirip dengan embrio kita yang sangat bermutasi dan menunjukkan β-cat yang sangat ditingkatkan.pewarnaan (D').Setelah aktivasi jalur PI3K-AKT, sel kontrol tetap berbentuk kuboid (E) dan memiliki pewarnaan β-cat (E') yang normal, sedangkan sel kd menunjukkan peningkatan signifikan dalam bentuk sel (F) dan pewarnaan β-cat (F'), yang menunjukkan (G) Tingkat perubahan bentuk sel (AF) diukur menggunakan rasio kebulatan sel (CCR) dari dimensi terpanjang (panjang) dan dimensi vertikal yang sesuai (lebar) menggunakan perangkat lunak MetaMorph.Sel SPECC1L-kd yang tidak diobati (NT) (CCR = 3,46) secara signifikan lebih panjang dibandingkan sel kontrol (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).Penghambatan Wort terhadap jalur PI3K-AKT dalam sel kontrol cukup untuk menyebabkan pemanjangan serupa dalam bentuk sel (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Demikian pula, aktivasi AKT oleh SC-79 dalam sel SPECC1L-kd mengembalikan pemanjangan sel ke tingkat kontrol (CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Pengobatan Wortmannin pada sel SPECC1L-kd menghasilkan peningkatan apoptosis tetapi tidak ada peningkatan lebih lanjut dalam perubahan bentuk sel (CCR=3,60) dibandingkan dengan kd yang tidak diobati (CCR=3,46, ns) atau sel kontrol yang diobati dengan wortmannin (3,61) yang diamati pada .ns = tidak masalah.+/- Pengukuran SEM untuk 50 sel ditampilkan.Perbedaan statistik dihitung menggunakan uji-t Student.
(A) Representasi skema penghambatan dan aktivasi jalur PI3K-AKT yang masing-masing menghasilkan perubahan dan penyelamatan AJ.(B) Model yang diusulkan untuk stabilisasi protein AKT oleh SPECC1L.
CNCC pramigrasi memerlukan lisis AJ untuk terpisah dari sel neuroepitel lipatan saraf anterior1,15,32.Peningkatan pewarnaan komponen AJ dan hilangnya distribusi asimetris apikal-basal AJ pada sel yang kekurangan SPECC1L baik in vitro dan in vivo, dikombinasikan dengan kedekatan fisik SPECC1L dengan β-catenin, menunjukkan bahwa SPECC1L berfungsi untuk menjaga stabilitas lokal AJ dengan baik untuk otot organisasi.sitoskeleton aktin.Hubungan SPECC1L dengan sitoskeleton aktin dan β-catenin dan peningkatan jumlah filamen aktin terkondensasi tanpa adanya SPECC1L konsisten dengan peningkatan kepadatan AJ yang diamati.Kemungkinan lain adalah peningkatan jumlah serat aktin pada sel yang kekurangan SPECC1L menyebabkan perubahan ketegangan antar sel.Karena tegangan seluler mempengaruhi dinamika AJ 33, perubahan tegangan dapat mengakibatkan AJ 34 lebih menyebar.Jadi perubahan apa pun akan mempengaruhi lapisan CNCC.
Wnt1 diekspresikan pada lipatan saraf awal yang menimbulkan sel puncak saraf.Dengan demikian, penelusuran garis keturunan Wnt1-cre menandai NCC35 sebelum dan migrasi.Namun, Wnt1 juga menandai klon jaringan otak dorsal yang juga berasal dari lipatan saraf awal, sehingga kemungkinan besar pewarnaan mutan E9.5 untuk penanda Wnt1 pada lipatan saraf terbuka bukanlah CNCC.Pewarnaan positif kami untuk penanda NCC AP2A dan SOX10 menegaskan bahwa lipatan saraf embrio mutan Specc11 yang terpapar memang mengandung CNCC.Selain itu, karena AP2A dan SOX10 adalah penanda NCC yang bermigrasi awal, pewarnaan positif menunjukkan bahwa sel-sel ini adalah CNCC pasca-migrasi yang tidak dapat dikelompokkan dengan E9.5.
Data kami menunjukkan bahwa regulasi molekuler AJ oleh SPECC1L dimediasi oleh pensinyalan PI3K-AKT.Pensinyalan AKT berkurang pada sel dan jaringan yang kekurangan SPECC1L.Temuan Fantauzzo dkk.mendukung peran langsung untuk pensinyalan PI3K-AKT dalam morfogenesis kraniofasial.(2014) menunjukkan bahwa kurangnya aktivasi sinyal PI3K-AKT berbasis PDGFRα menyebabkan fenotip langit-langit mulut sumbing.Kami juga menunjukkan bahwa penghambatan jalur PI3K-AKT cukup untuk mengubah AJ dan bentuk sel pada sel U2OS.Konsisten dengan temuan kami, Cain et al.37 menunjukkan bahwa downregulasi subunit PI3K α110 pada sel endotel menghasilkan peningkatan serupa pada pewarnaan β-catenin periseluler, yang disebut sebagai peningkatan “indeks konektivitas”.Namun, pada sel endotel yang filamen aktinnya sudah sangat terorganisir, penekanan jalur PI3K-AKT menghasilkan bentuk sel yang longgar.Sebaliknya, sel SPECC1L-kd U2OS menunjukkan bentuk sel yang memanjang.Perbedaan ini mungkin spesifik pada tipe sel.Meskipun penekanan sinyal PI3K-AKT secara permanen mempengaruhi sitoskeleton aktin, pengaruhnya terhadap bentuk sel ditentukan oleh perubahan tegangan yang disebabkan oleh perubahan kepadatan dan pengorganisasian serat aktin pusat.Dalam sel U2OS, kami hanya menggunakan perubahan bentuk sel sebagai penanda perubahan dan pemulihan AJ yang kekurangan SPECC1L.Sebagai kesimpulan, kami berhipotesis bahwa penghambatan jalur AKT pada defisiensi SPECC1L meningkatkan stabilitas AJ dan mengurangi delaminasi pada CNCC.
Menariknya, kadar pan-AKT berkurang secara in vitro dan in vivo selain kadar 473-AKT terfosforilasi tanpa adanya SPECC1L, menunjukkan regulasi pensinyalan PI3K-AKT pada tingkat stabilitas atau pergantian protein AKT.Gen SPECC1L dan MID1, keduanya terkait dengan sindrom Opitz/GBBB, mengkode protein yang menstabilkan mikrotubulus 18,22 .Mekanisme dimana SPECC1L dan MID1 memediasi stabilisasi mikrotubulus belum sepenuhnya dipahami.Dalam kasus SPECC1L, stabilisasi ini mencakup peningkatan asetilasi subset mikrotubulus 18 .Ada kemungkinan bahwa SPECC1L menggunakan mekanisme serupa untuk menstabilkan protein lain seperti AKT.Telah terbukti bahwa asetilasi residu lisin dalam protein AKT menyebabkan penurunan lokalisasi membran dan fosforilasi38.Selain itu, keberadaan rantai K63 pada residu lisin yang sama pada AKT diperlukan untuk lokalisasi dan aktivasi membrannya39,40.Di antara beberapa faktor yang berinteraksi dengan protein SPECC1L yang diidentifikasi dalam berbagai layar dua-hibrida ragi dengan throughput tinggi, empat – CCDC841, ECM2942, APC dan UBE2I43 – telah terlibat dalam pergantian atau stabilitas protein melalui ubiquitinasi atau sumoylasi.SPECC1L mungkin terlibat dalam modifikasi residu lisin AKT pasca-translasi, yang mempengaruhi stabilitas AKT.Namun, peran penting SPECC1L dalam lokalisasi dan stabilitas protein AKT masih harus dijelaskan.
Cacat parah pada ekspresi SPECC1L in vivo mengakibatkan peningkatan pewarnaan penanda AJ dan cacat pelapisan CNCC, serta peningkatan apoptosis dan kematian embrio dini.Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa mutan tikus dengan peningkatan tingkat apoptosis berhubungan dengan cacat tabung saraf44,45,46,47 dan cacat kraniofasial48.Telah dikemukakan bahwa kematian sel yang berlebihan pada lipatan saraf atau lengkung faring dapat mengakibatkan jumlah sel yang dibutuhkan untuk pergerakan morfogenetik yang tepat tidak mencukupi 48,49,50.Sebaliknya, garis sel kekurangan SPECC1L kami dengan ekspresi SPECC1L yang berkurang hanya menunjukkan perubahan AJ tanpa bukti peningkatan kematian sel.Namun, penghambatan kimiawi jalur PI3K-AKT pada sel Kd ini menghasilkan peningkatan apoptosis.Dengan demikian, penurunan moderat dalam ekspresi atau fungsi SPECC1L memastikan kelangsungan hidup sel.Hal ini konsisten dengan pengamatan bahwa embrio mutan Specc11 langka yang lolos dari penangkapan di st.E9.5—mungkin karena berkurangnya efisiensi penangkapan gen—mampu menutup tabung sarafnya dan berhenti berkembang di kemudian hari, seringkali dengan cacat kraniofasial (Gbr. S3).Yang juga konsisten dengan hal ini adalah jarangnya kejadian embrio Specc1l heterozigot dengan kelainan kraniofasial—mungkin karena peningkatan efisiensi penangkapan gen—serta temuan pada ikan zebra di mana salah satu dari dua ortolog SPECC1L (specc1lb) menyebabkan fenotipe embrio akhir, termasuk hilangnya rahang bawah dan celah bilateral51.Dengan demikian, hilangnya mutasi fungsi SPECC1L heterozigot yang diidentifikasi pada pasien manusia dapat menyebabkan gangguan kecil pada fungsi SPECC1L selama morfogenesis kraniofasial, cukup untuk menjelaskan celah orofasial mereka.Regulasi kontak antar sel berbasis SPECC1L juga mungkin berperan dalam palatogenesis dan fusi lengkung faring.Studi lebih lanjut tentang fungsi SPECC1L akan membantu menjelaskan peran kontak antar sel sementara di CNCC selama penutupan tabung saraf dalam motilitas sel neuroepitel dan morfogenesis kraniofasial.
Kontrol osteosarkoma U2OS dan sel SPECC1L-kd telah dijelaskan sebelumnya (Saadi et al., 2011).Antibodi terhadap SPECC1L juga telah dikarakterisasi sebelumnya (Saadi et al., 2011).Antibodi anti-β-catenin (kelinci; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (tikus; 1:1000; Teknologi Sinyal Sel, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colorado), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Teknologi Sinyal Sel, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Teknologi Sinyal Sel, Danvers, MA), caspase 3 terpecah (1:1000; Teknologi Sinyal Sel, Danvers, MA) dan β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) digunakan seperti yang dijelaskan..Filamen aktin diwarnai dengan Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Sel kontrol U2OS dan sel SPECC1L-kd dikultur dalam DMEM glukosa tinggi standar yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (Life Technologies, Carlsbad, CA).Untuk perubahan AJ, 2 x 105 sel diunggulkan pada kaca yang diberi gelatin babi 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dan diamati perubahan bentuk selnya.Sel dikumpulkan pada titik waktu berbeda yang ditunjukkan: 4 jam setelah penyemaian (t = 1), 24 jam setelah penyemaian (t = 2), pertemuan tanpa perubahan bentuk sel (t = 3), perubahan bentuk sel (t = 4) , 24 jam setelah perubahan bentuk sel (t = 5) dan 48 jam setelah perubahan bentuk sel (t = 6) (Gbr. 1, 2, 3).Untuk memodulasi jalur PI3K-AKT, sel dikultur pada konsentrasi yang ditunjukkan dengan inhibitor PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) atau aktivator SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Media yang mengandung bahan kimia diganti setiap hari.
Rekaman frame-by-frame dibuat pada kontrol langsung dan sel KD dalam kondisi kultur normal, dan gambar fase kontras dikumpulkan setiap 10 menit selama 7 hari.Gambar diperoleh menggunakan mikroskop terbalik Leica DM IRB yang dikendalikan komputer yang dilengkapi dengan panggung mekanis dan tujuan 10 × N-PLAN yang terhubung ke kamera QImaging Retiga-SRV.Selama pencitraan, kultur sel dipertahankan pada suhu 37°C dalam atmosfer lembab dengan 5% CO2.
Dua garis sel ES perangkap gen DTM096 dan RRH048 dari Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) digunakan untuk menghasilkan garis tikus yang kekurangan Specc11, yang disebut Specc1lgtDTM096 dan Specc1lgtRRH046.Secara singkat, sel 129/REJ ES disuntikkan ke dalam blastokista C57BL6.Tikus jantan chimeric yang dihasilkan dikawinkan dengan tikus betina C57BL6 untuk mengidentifikasi keturunan dengan warna bulu agouti.Kehadiran sisipan vektor perangkap gen digunakan untuk mengidentifikasi heterozigot.Tikus dipelihara dengan latar belakang campuran 129/REJ;C57BL6.Lokasi tempat penyisipan vektor perangkap genetik dikonfirmasi oleh RT-PCR, sekuensing genom, dan komplementasi genetik (Gambar Tambahan 1).Untuk menelusuri garis keturunan CNCC dari tikus Specc1lGT heterozigot ganda, tikus ROSAmTmG (#007576) dan Wnt1-Cre (#003829) (Laboratorium Jackson, Bar Harbor, ME) disilangkan untuk menghasilkan alel ROSAmTmG dan Wnt1-Cre dalam embrio mutan Specc1l.Semua percobaan pada tikus dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari University of Kansas Medical Center.
Embrio difiksasi dalam (1% formaldehida, 0,2% glutaraldehid, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) selama 60 menit pada suhu kamar.Setelah fiksasi dalam larutan pewarnaan X-gal (5 mM potasium ferricyanide, 5 mM potasium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0,01% sodium deoxycholate, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Pengembangan noda dilakukan pada suhu 37°C .°C dalam waktu 1-6 jam.Embrio difiksasi dalam PFA 4% dan divisualisasikan.
Untuk Western blotting, sel-sel dilisiskan dalam buffer lisis pasif (Promega, Fitchburg, WI) yang dilengkapi dengan campuran inhibitor protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lisat diproses pada gel siap pakai Mini-PROTEAN TGX poliakrilamida 12% (Bio-Rad, Hercules, CA) dan ditransfer ke membran Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Membran diblokir dalam susu 5% dalam PBS yang mengandung 0,1% Tween.Antibodi diinkubasi semalaman pada suhu 4°C atau selama satu jam pada suhu kamar.Reagen Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) digunakan untuk menghasilkan sinyal.Untuk immunostaining, embrio difiksasi semalaman dalam PFA/PBS 4% dan dikriopreservasi.Cryosection jaringan diblokir dalam PBS yang mengandung 1% serum kambing normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) dan 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dan kemudian diinkubasi pada suhu 4°C dalam inkubator selama malam.dengan anti-antibodi dan antibodi sekunder fluoresen (1:1000) selama 1 jam pada suhu 4°C.Bagian yang diwarnai ditempatkan dalam media emas ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) dan gambar datar diperoleh menggunakan mikroskop confocal Leica TCS SPE.Setiap immunostaining dilakukan sebagai tiga percobaan independen pada cirossection dari setidaknya dua embrio mutan.Eksperimen yang representatif ditampilkan.
Sel diinkubasi dalam buffer RIPA yang dimodifikasi (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliserol, 2 mM EDTA, dan HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Secara singkat, lisat dimurnikan terlebih dahulu dengan manik-manik magnetik protein G (Life Technologies, Carlsbad, CA) dan kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C. dengan manik-manik protein G anti-SPECC1L atau IgG digunakan untuk mengekstrak SPECC1L dan Western blotting dilakukan menggunakan anti-SPECC1L. Antibodi -β-catenin yang dijelaskan di atas Eksperimen co-IP yang ditampilkan mewakili empat eksperimen independen.
Sel kultur tetap atau jaringan embrio tikus diberikan ke pusat mikroskop elektron di University of Kansas Medical Center.Secara singkat, sampel ditanam dalam resin EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), dipolimerisasi semalaman pada suhu 60°C, dan dipotong pada 80 nm menggunakan ultramikrotom Leica UC7 yang dilengkapi dengan pisau berlian.Bagian divisualisasikan menggunakan mikroskop elektron transmisi JEOL JEM-1400 yang dilengkapi dengan senjata Lab6 100 kV.
Cara mengutip artikel ini : Wilson, NR dkk.Defisiensi SPECC1L menyebabkan peningkatan stabilitas sendi yang disambung dan berkurangnya delaminasi sel krista saraf kranial.ilmu.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induksi dan diferensiasi puncak saraf.(Springer Science + Media Bisnis; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR dkk.Sel puncak saraf kranial bergerak: perannya dalam perkembangan kraniofasial.Jurnal Genetika Medis Amerika.Bagian A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: pertumbuhan dan perkembangannya selama 20 tahun.Dokter anak.patologi.laboratorium.obat-obatan.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU dan Noten MM Terobosan dalam genetika celah orofasial.Tren Kedokteran Molekuler 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. dan Riley, FM Mekanisme molekuler migrasi dan pola sel krista saraf kranial selama perkembangan kraniofasial.Pengembangan 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH dan Murray, JK Bibir sumbing dan langit-langit: memahami pengaruh genetik dan lingkungan.komentar alami.Genetika 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR dkk.Morfogenesis abnormal pada kulit, anggota badan, dan daerah kraniofasial pada tikus yang kekurangan faktor pengatur interferon-6 (Irf6).Genette Nasional.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. dkk.Mutasi dominan pada GRHL3 menyebabkan sindrom van der Waord dan mengganggu perkembangan periderm mulut.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ dan Juriloff, DM Perbarui daftar mutan tikus dengan cacat pada penutupan tabung saraf dan kemajuan menuju pemahaman genetik lengkap tentang penutupan tabung saraf.Investigasi cacat lahir.Bagian A, Teratologi Klinis dan Molekuler 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Pensinyalan PDGFRalpha yang dimediasi Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K mengatur kelangsungan hidup dan proliferasi dalam perkembangan kerangka melalui jalur intraseluler yang bergantung pada p53.Pengembangan Gen 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND dan Murdoch, JN Acak-acak: Hubungan ekspansi konvergen dengan penutupan tabung saraf.Tren neurologi.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).