347 komponen kimia tabung melingkar baja tahan karat, Identifikasi protein pendamping antigen-A leukosit manusia (HLA-A) yang responsif terhadap interferon baru menggunakan spektrometri massa ikatan silang (CLMS)

Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Slider menampilkan tiga artikel per slide.Gunakan tombol kembali dan berikutnya untuk menelusuri slide, atau tombol pengontrol slide di akhir untuk menelusuri setiap slide.

Deskripsi Produk

Tabung Kumparan Stainless Steel 347L, Kelas Baja: SS347L

Sistem pensinyalan interferon menginduksi respons sitokin yang kuat terhadap berbagai sinyal patologis patogen dan intrinsik dari lingkungan, sehingga menghasilkan induksi subset protein yang dapat diinduksi interferon.Kami menerapkan spektrometri massa tautan silang (CLMS) yang dimediasi DSS untuk mendeteksi interaksi protein-protein baru dalam domain protein yang diinduksi interferon.Selain protein yang diinduksi interferon yang diharapkan, kami juga mengidentifikasi hasil tambahan baru antarmolekul dan intramolekul dari protein yang diinduksi interferon kanonik seperti MX1, USP18, OAS3, dan STAT1.Kami fokus pada validasi ortogonal dari serangkaian jaringan protein yang diinduksi interferon yang dibentuk oleh protein HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) menggunakan ko-imunopresipitasi dan studi lebih lanjut menggunakan pemodelan dinamika molekul.Pemodelan dinamika konformasi kompleks protein mengungkapkan beberapa situs interaksi yang mencerminkan interaksi yang diidentifikasi dalam temuan CLMS.Bersama-sama, kami menyajikan studi percontohan CLMS untuk mengidentifikasi kompleks pensinyalan baru yang disebabkan oleh interferon, dan menantikan penggunaan CLMS yang lebih luas untuk mengidentifikasi dinamika baru interaksi protein dalam lingkungan mikro tumor.
Sebelum respon imun adaptif dimulai, sistem pertahanan bawaan host memasang respon antimikroba yang dimediasi oleh sekelompok sitokin alfa-heliks yang disebut interferon (IFNs).Kelas IFN tipe I IFNα dan IFNβ mengaktifkan respons seluler, termasuk status antivirus, proapoptosis, proinflamasi, dan antiproliferatif.Pada manusia, 13 subtipe IFNα diketahui, semuanya dikelompokkan pada kromosom 91. Yang mengejutkan, hanya IFNα2 yang telah dipelajari untuk penggunaan klinis.Baru-baru ini, perhatian khusus telah diberikan pada penelitian subtipe IFNα lainnya.Sebuah penelitian baru-baru ini menunjukkan bahwa IFNα14 adalah salah satu isoform yang paling efektif dalam membatasi replikasi HBV2 dan HIV-13,4 dibandingkan dengan subtipe IFNα2 kanonik.
Telah ditetapkan bahwa kompleks reseptor interferon tipe I yang diaktifkan (IFNAR1 dan IFNAR2) memicu kaskade transduksi sinyal yang dimediasi oleh Janus kinases TYK2 dan JAK15,6.Janus kinase ini memfosforilasi sinyal transduser dan aktivator protein transkripsional (STAT1 dan STAT2) pada residu tirosin untuk memulai heterodimerisasi yang dimediasi domain SH2.Selanjutnya, IRF9 mengikat heterodimer STAT untuk membentuk kompleks trimerik gen faktor 3 yang distimulasi IFN (ISGF3), yang bertranslokasi ke nukleus dan menginduksi transkripsi lebih dari 2000 gen yang distimulasi interferon (ISGs)5,6,7,8.
ISG membentuk tulang punggung sistem kekebalan bawaan, terutama sebagai respons terhadap serangan virus.Sebagai garis pertahanan pertama melawan infeksi virus, sel dengan cepat menyebarkan interaksi ekstensif protein seluler dengan beragam aktivitas biologis.Protein-protein ini termasuk reseptor pengenalan pola, molekul pemberi sinyal, faktor transkripsi, dan protein dengan fungsi antivirus langsung, serta pengatur negatif respon imun9.Sebagian besar informasi mengenai aktivitas ISG berasal dari skrining fungsional yang menggunakan skrining ekspresi berlebih10,11 atau teknik pembungkaman gen (siRNA, RNAi, dan CRISPR)12,13 di mana masing-masing ISG diekspresikan atau dihambat dan aktivitasnya diuji pada berbagai virus.Meskipun penelitian ini telah menentukan sifat antivirus dari masing-masing ISG, mekanisme molekuler yang mendasari setiap ISG sebagian besar masih belum diketahui.Secara umum diterima bahwa banyak protein berinteraksi dengan satu atau lebih sitokin untuk memastikan aktivitas penuh, sehingga ISG berinteraksi secara langsung atau interaksinya dimediasi oleh protein seluler.Misalnya, studi proteomik fotocrosslinked baru-baru ini mengidentifikasi ATPase VCP/p97 sebagai mitra interaksi utama IFITM3, yang penghambatannya menyebabkan kerusakan pada penyortiran lisosom, pergantian, dan kotransportasi IFITM3 dengan partikel virus 14 .Dengan menggunakan imunopresipitasi, kami mengidentifikasi VAPA, protein terkait vesikel, sebagai mitra interaksi dengan IFITM1/2/3 yang memediasi pematangan virus yang dimediasi kolesterol, dan hal ini dikonfirmasi oleh penelitian lain yang menggunakan sistem dua-hibrida ragi.Dukungan Ilmiah 15, 16.
Proses biologis mendasar yang terlibat dalam penekanan infeksi dan transformasi ganas adalah presentasi antigen, yang dimediasi oleh molekul mayor histokompatibilitas kompleks (MHC).Peptida (panjang 8-12 asam amino) dari protein yang terpecah, terminasi dini, atau salah lipatan dimasukkan ke dalam heterodimer MHC-I (terdiri dari rantai berat dan ringan MHC-I, yang disebut β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18 .Trimer MHC-I stabil yang dihasilkan diangkut ke permukaan sel, di mana mereka menyajikan peptida intraseluler ke sel T CD8+ (sel T sitotoksik)17.Sel T mengenali dan menghancurkan patogen ini dan sel yang membawa antigen spesifik tumor.Akibatnya, patogen dan sel tumor sering kali menekan proses presentasi antigen untuk menghindari pengawasan kekebalan.Selain itu, MHC-I mengalami penurunan regulasi pada 40-90% tumor manusia dan sering dikaitkan dengan prognosis yang lebih buruk19.
Gen yang terlibat dalam merespons patogen harus dengan cepat beralih antara keadaan istirahat dan keadaan transkripsi aktif.Oleh karena itu, beberapa protein seluler dihipotesiskan terlibat dalam respons terhadap permintaan IFN yang tinggi dalam periode waktu yang singkat, termasuk remodeling dan modifikasi kromatin promotor 20,21 .Sebagian besar penelitian berfokus pada identifikasi pasangan protein ISG individu dengan adanya IFN.Beberapa studi proteomik dan transkriptomik dalam sistem sel model telah menjelaskan efek IFN pada lanskap seluler.Namun, meskipun pemahaman tentang dinamika yang disebabkan oleh interferon semakin berkembang, kita masih hanya mengetahui sedikit tentang keterlibatan ISG.Ketika mempertimbangkan kompleksitas dan dinamika pensinyalan interferon yang bergantung pada waktu, muncul dua pertanyaan: (i) apakah mungkin untuk menstabilkan dan menjebak kompleks multiprotein yang terlibat dalam pensinyalan cepat, dan (ii) dapatkah interaksi ini dipetakan ke dalam ruang 3D?
Untuk mengatasi masalah ini, kami menerapkan ikatan silang kimia (DSS) yang dimediasi suberat disuccinimide ditambah dengan spektrometri massa (CLMS) untuk mempelajari jaringan interaksi protein yang diinduksi IFNα dan dinamikanya.DSS menambahkan ikatan kovalen antara residu protein proksimal dan/atau kompleks protein in vivo.Analisis MS selanjutnya mengungkapkan situs ikatan silang spesifik yang mencerminkan kedekatan spasial wilayah dalam protein tertentu, yang disebut hubungan internal, atau subunit dalam kompleks protein, yang disebut hubungan timbal balik.Dengan menggunakan pendekatan ini, kami telah mengidentifikasi beberapa kompleks protein-protein baru serta jaringan interaksi multiprotein yang diinduksi interferon.Dengan menguji lebih lanjut sebagian dari interaksi baru ini, kami menunjukkan bahwa H2BFS (FS tipe histone H2B; selanjutnya disebut H2B) dan MDN1 bertindak sebagai mitra pengikat untuk HLA-A.
Sel Flo-1 adalah salah satu model adenokarsinoma esofagus in vitro yang paling terkenal karena meniru ciri-ciri utama tumor esofagus22,23.Namun, tidak semua tumor bersifat imunogenik, dan untuk menentukan apakah sel Flo-1 merespons pengobatan interferon, kami merawat sel Flo-1 dengan 10 ng/ml IFNα selama 72 jam.Sel Flo-1 menunjukkan induksi awal pSTAT1 dan IRF1, dimulai 2 jam setelah pengobatan dan berlanjut selama 72 jam, dengan penurunan tingkat stasioner IRF1 yang bergantung pada waktu (Gambar 1A).ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2, dan ISG15) ditemukan terinduksi kuat setelah 6 jam, meniru respons klasik fase pertengahan dan akhir terhadap IFNα (Gambar 1A).Bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa model seluler ini dapat digunakan untuk mempelajari respons interferon.
Respons ekspresi protein diferensial dalam sel Flo-1 setelah pengobatan IFNα.(A) Ekspresi protein dalam sel Flo-1 yang diobati dengan 10 ng/ml IFNα selama 2, 6, 24, 48 dan 72 jam dianalisis dengan imunoblot menggunakan antibodi ISG yang ditunjukkan.(B) Gel SDS-PAGE bernoda biru Coomassie dari ekstrak seluruh sel setelah dihubungkan silang dengan DSS untuk waktu dan konsentrasi yang ditunjukkan.(C) Immunoblot representatif diperiksa dengan antibodi p53(DO-1) dari sampel yang sama untuk menilai derajat ikatan silang protein.
Untuk menangkap lanskap interaksi protein in situ, kami menggunakan DSS, agen pengikat silang yang banyak digunakan karena permeabilitas membrannya yang tinggi dan waktu reaksi yang relatif singkat.Waktu reaksi yang lebih singkat membantu mencegah pembentukan agregat besar protein berikatan silang, sehingga menjaga stabilitas pengikat silang.Untuk menentukan konsentrasi DSS yang optimal dan menghindari ikatan silang yang berlebihan, pertama-tama kami mengekspos sel ke 5, 2,5, dan 1 mM DSS masing-masing selama 5, 10, 5, dan 30 menit, dan menganalisis lisat dengan SDS-PAGE yang diwarnai Coomassie. (data tidak ditampilkan).Lisat sel tampaknya memiliki ikatan silang yang tinggi pada konsentrasi terendah dan pada titik waktu terpendek.Oleh karena itu, DSS dititrasi menjadi 1, 0,5, dan 0,1 mM selama 5 menit (Gambar 1B).Ikatan silang optimal diamati dengan DSS 0,5 mM selama 5 menit, dan kondisi ini dipilih untuk sel yang diobati dengan IFNα.Selain itu, Gambar 1C menunjukkan Western blot yang dilakukan menggunakan antibodi p53 (DO-1) untuk menilai tingkat ikatan silang protein.
Sel Flo-1 diobati dengan 10 ng/ml IFNα selama 24 jam sebelum menambahkan pengikat silang.Sel-sel yang berikatan silang kemudian dilisiskan dengan proteolisis dua langkah dan protein diproses oleh FASP (Gbr. 2)24,25.Peptida tryptic ikatan silang dianalisis dengan spektrometri massa (Gbr. 2).Spektrum MS/MS kemudian dicocokkan dengan urutan protein dan diukur dengan MaxQuant26,27.Peptida yang berikatan silang diidentifikasi dari spektrum yang diperoleh menggunakan program SIM-XL, dan masing-masing senyawa digabungkan menjadi jaringan yang kompleks menggunakan jaringan pipa perangkat lunak komputasi sumber terbuka xQuest28 dan SIM-XL29 (Gbr. 2).SIM-XL mengidentifikasi interaksi protein-protein, rantai internal dan rantai individu dalam campuran protein sederhana atau kompleks dan menyediakan skrip untuk memvisualisasikan interaksi dalam struktur protein.Selain itu, ia memberi peringkat pada setiap referensi silang sebagai skor ID berdasarkan kualitas spektrum MS/MS29.Beberapa interaksi dan kompleks protein-protein yang sangat andal telah diidentifikasi, dan serangkaian interaksi baru telah diselidiki lebih lanjut menggunakan ko-imunopresipitasi dan perubahan konformasi kompleks menggunakan pemodelan dinamika molekuler (MD) (Gbr. 2) 30, 31.
Ikhtisar skema metode CLMS.Sel Flo-1 diobati dengan 10 ng/ml IFNα selama 24 jam diikuti dengan ikatan silang protein in situ menggunakan DSS diikuti dengan lisis sel dan trypsinization.Sampel ikatan silang dianalisis menggunakan spektrometer massa Orbitrap dan selanjutnya diambil sampelnya untuk fragmentasi prekursor peptida selama LC-MS/MS.Dua peptida terkait diidentifikasi dari spektrum yang diperoleh menggunakan program Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), dan semua senyawa digabungkan menjadi jaringan kompleks menggunakan jalur pipa komputasi.Filter interaksi dengan tingkat kepercayaan rendah berdasarkan skor tingkat positif palsu (FDR).Beberapa interaksi protein-protein dengan ketelitian tinggi baru dikonfirmasi lebih lanjut menggunakan ko-imunopresipitasi, dan perubahan konformasi dalam kompleks diperiksa menggunakan pemodelan dinamika molekuler (MD).
Sebanyak ~30.500 dan ~28.500 peptida terdeteksi menggunakan MaxQuant masing-masing dalam sampel IFNα yang tidak distimulasi dan distimulasi (Tabel Tambahan S1, Gambar 3A).Distribusi panjang peptida pada kedua kasus menunjukkan proporsi peptida besar yang lebih tinggi, yang menunjukkan adanya ikatan silang peptida (Gambar 3B,C).Selain itu, proporsi peptida yang lebih besar hadir dalam kisaran 40-55 dalam sampel yang diberi IFNα (Gambar 3C).Pemetaan protein terhadap intensitas log2 menunjukkan bahwa protein klasik yang distimulasi interferon adalah yang paling melimpah dibandingkan dengan sampel yang tidak diberi perlakuan, termasuk MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, dan HLA-F (Gambar 3D).Analisis jalur untuk protein yang diperkaya lebih dari tiga kali lipat sebagai respons terhadap pengobatan IFNα menggunakan database jalur Reactome menunjukkan bahwa presentasi dan pemrosesan antigen yang dimediasi MHC-I adalah jalur yang paling dominan (Gambar 3E).Konsisten dengan laporan sebelumnya, tanggapan antivirus yang dimediasi oleh OAS dan ISG15 serta sinyal IFNα/β dan sitokin termasuk di antara jalur yang diaktifkan.Selain itu, ikatan silang protein spesifik lisin dan serin diidentifikasi dari spektrum MS/MS yang awalnya diperoleh menggunakan SIM-XL.Sebuah penelitian baru-baru ini melaporkan 104 ISG yang mencakup 20 virus dari 9 kelas virus melalui meta-analisis studi overekspresi ISG individu pada 5 tipe sel9.Namun, untuk mengatasi keterbatasan komputasi dalam menyaring kumpulan data yang besar, kami memulai dengan kumpulan data yang lebih kecil untuk mengeksplorasi kemungkinan interaksi antara daftar gen IRDS yang dilaporkan oleh Padaria et al., yang sebagian besar adalah ISG.
Identifikasi protein ikatan silang yang diekspresikan secara berbeda sebagai respons terhadap IFNα (data diperoleh dari MaxQuant).(A) Diagram Venn mewakili jumlah peptida umum dan eksklusif yang diidentifikasi dalam sampel Flo-1 yang diberi perlakuan dan tidak diberi IFNα14.Distribusi panjang peptida dari sampel ikatan silang yang tidak diberi perlakuan (B) dan yang diberi perlakuan IFNα (C).(D) Peta panas yang mewakili log2 (intensitas LFQ) antara sel Flo-1 yang tidak diberi perlakuan dan yang diberi IFNα14.Panel kiri menunjukkan protein yang paling aktif diaktifkan dengan adanya IFNα.(E) Histogram mewakili 20 jalur pengayaan utama setelah pengobatan IFNα.Basis data jalur Reactome menganalisis lebih dari empat kali lipat perubahan pada protein responsif IFNα yang diregulasi.
Stimulasi ISG yang dimediasi interferon telah didokumentasikan dengan baik, namun pada tingkat molekuler masih kurang dipahami bagaimana protein ini berujung pada berbagai fungsi biologis.Kami menyelidiki interaksi protein dengan tingkat kepercayaan yang tinggi antara ISG yang diketahui.Menariknya, kami mengidentifikasi jaringan termasuk protein MX1, USP18, ROBO1, OAS3, dan STAT1 yang membentuk kompleks besar sebagai respons terhadap pengobatan IFNα (Gambar 4, Tabel S2) 32,33,34.Yang paling penting, interaksi ini ditemukan pada semua rangkap tiga yang diobati dengan IFNα dan tidak ditemukan pada sampel yang tidak diobati, menunjukkan bahwa interaksi tersebut terbentuk secara spesifik sebagai respons terhadap pengobatan IFNα.Diketahui bahwa STAT1 secara transkripsi mengatur ekspresi ISG ini, namun interaksinya dengan ISG pada tingkat protein belum diteliti.Struktur kristal STAT1 menunjukkan bahwa domain heliksnya (CCD) tidak terlibat dalam interaksi dengan DNA atau protomer selama pembentukan dimer35.Heliks α ini membentuk struktur heliks heliks yang menyediakan luas permukaan hidrofilik yang dominan agar interaksi dapat terjadi 35 .Dalam data CLMS kami, kami mengamati bahwa sebagian besar interaksi dengan STAT1 terjadi di domain SH2 sebelum CCD, domain linker, atau ekor terminal-C (residu 700-708) (Gambar 4A).Sebuah penelitian sebelumnya melaporkan bahwa USP18 berikatan dengan CCD dan domain pengikatan DNA (DBD) STAT2 dan direkrut ke subunit reseptor interferon tipe I IFNAR2 untuk memediasi penghambatan sinyal interferon tipe I 24 .Data kami juga menunjukkan bahwa domain katalitik USP18 berinteraksi dengan STAT1 DBD (Gambar 4A,D), menunjukkan bahwa STAT1 dan STAT2 mungkin berperan dalam menarik USP18 ke IFNAR2.
Jaringan protein-protein ISG diidentifikasi dalam sel-sel ikatan silang yang diobati dengan IFNα.(A) Plot interaksi 2D menunjukkan interaksi protein-protein (dihasilkan dalam program SIM-XL), dengan garis yang mewakili interaksi antarmolekul (batas ikatan silang diatur ke 3,5).Domain dengan identitas berbeda ditandai berdasarkan warnanya32: domain MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), dan GED (569–660).Domain OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), dan OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) dan fn3 (777–864).Bidang STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), dan STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Penampil melingkar protein ikatan silang (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, dan STAT1) dengan interaksi dan interaksi masing-masing diberi label biru dan merah.Ambang batas tautan silang ditetapkan sebesar 3,5.Plot titik menunjukkan situs interaksi STAT1 dengan MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), dan OAS3 (F), serta situs interaksi K atau S antara kedua peptida.Pada gambar, ambang batas skor tautan silang ditetapkan ke 3,0.(G) Berbagai situs interaksi antara domain STAT1 dan OAS3 DI yang ditumpangkan pada struktur proteinnya di PyMol (sistem grafik molekuler PyMOL, versi 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (id pdb: 1bf533) dan OAS3 (id pdb: 4s3n34).) program.
Dua isoform USP18 telah dideskripsikan pada manusia, protein full-length yang sebagian besar terletak di nukleus, dan isoform tanpa domain N-terminal, USP18-sf, yang didistribusikan secara merata di sitoplasma dan nukleus 36 .Selain itu, N-terminus diperkirakan tidak terstruktur dan tidak memerlukan aktivitas isopeptidase atau pengikatan ISG1537.Sebagian besar interaksi yang diidentifikasi dalam penelitian kami terletak di ujung-N protein, menunjukkan bahwa interaksi ini melibatkan USP18 full-length (Gambar 4A,D) dan kemungkinan terjadi di dalam nukleus.Selain itu, data kami juga menunjukkan bahwa N-terminus dikhususkan untuk interaksi protein-ke-protein.Situs pengikatan IFNAR2 terletak di antara residu 312-368, dan khususnya, tidak ada protein dalam kompleks yang berikatan dengan wilayah ini (Gambar 4A) 37,38 .Data-data ini secara keseluruhan menunjukkan bahwa domain pengikatan IFNAR2 secara eksklusif digunakan oleh protein reseptor.Selain itu, hanya OAS3 dan ROBO1 yang ditemukan terkait dengan domain hulu dari situs pengikatan N-terminus dan IFNAR2 (Gambar 4A).
ROBO1 termasuk dalam superfamili imunoglobulin (Ig) dari molekul pemberi sinyal transmembran dan terdiri dari lima domain Ig dan tiga domain fibronektin (Fn) di wilayah ekstraseluler.Domain ekstraseluler ini diikuti oleh wilayah proksimal membran dan heliks transmembran tunggal. Wilayah intraseluler yang tidak terstruktur terletak di terminal-C dan berisi motif urutan yang dilestarikan yang memediasi pengikatan protein efektor.Wilayah yang terbentang dari asam amino ~1100 hingga 1600 sebagian besar tidak teratur.Kami menemukan bahwa MX1 berinteraksi dengan ROBO1 melalui Ig, Fn, dan domain intraseluler, sementara sebagian besar interaksi dengan STAT1 terjadi antara CCD, domain linker, dan terminal C ROBO1 (Gbr. 4A,E).Di sisi lain, interaksi dengan daerah penghubung DI, DIII, dan OAS3 didistribusikan ke seluruh protein ROBO1 (Gambar 4A).
Keluarga protein oligoadenylate synthase (OAS) menerima dan mengikat double-stranded RNA (dsRNA) intraseluler, mengalami perubahan konformasi, dan mensintesis oligoadenylate terkait 2′,5′ (2-5 As) 40 .Ditemukan bahwa di antara ketiga OAS, OAS3 menunjukkan afinitas tertinggi terhadap dsRNA dan mensintesis 2-5 As dalam jumlah paling sedikit, yang dapat mengaktifkan RNase L dan dengan demikian membatasi replikasi virus41 .Keluarga OAS terdiri dari domain transferase nukleotida seperti polimerase beta (pol-β).Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa aktivitas katalitik domain C-terminal (DIII) bergantung pada domain pengikat dsRNA (DI), yang diperlukan untuk aktivasi OAS342.Kami mengamati bahwa domain DI dan DII dari OAS3 berinteraksi dengan CCD dan daerah persimpangan kecil antara SH2 dan STAT1 TAD (Gambar 4A,F).Melapisi situs ikatan silang yang berbeda pada struktur protein mengungkapkan interaksi antara β-sheet dan loop DBD STAT1 dan kantong terbuka atau rongga yang dibentuk oleh residu 60-75 dalam domain DI OAS3 (Gbr. 4G).Orientasi protein dalam kompleks juga menunjukkan bahwa tidak ada interaksi dengan OAS3 yang mengganggu kemampuan pengikatan DNA pada domain DI-nya (Gambar S1A).Selain itu, domain N-terminal GTPase MX1 berinteraksi secara luas dengan domain DI dan DIII OAS3 (Gbr. 4A).Kami juga mengamati interaksi antara OAS1 dan MX1 di ketiga pengulangan yang diberi perlakuan IFNα, di mana satu domain OAS1 (juga aktif secara katalitik) berinteraksi dengan ketiga domain MX1 (Gambar S2A,B).
Protein MX adalah bagian dari keluarga besar GTPase mirip dynein yang mengandung domain N-terminal GTPase yang mengikat dan menghidrolisis GTP, domain perantara yang memediasi perakitan mandiri, dan ritsleting leusin terminal-C yang bertindak sebagai GTPase (LZ ).domain efektor domain25,43.MX1 berikatan dengan subunit polimerase virus untuk memblokir transkripsi gen virus43.Layar dua-hibrida ragi yang dilaporkan sebelumnya menunjukkan bahwa MX1 yang terkait dengan PIAS1 menghambat aktivasi gen yang dimediasi STAT1 dengan memblokir aktivitas pengikatan DNA dan juga memiliki aktivitas ligase SUMO E344,45.Di sini, kami menunjukkan bahwa MX1 berikatan dengan STAT1 (Gambar 4C,D), namun bagaimana interaksi ini mempengaruhi aktivasi gen yang dimediasi STAT1 sebagai respons terhadap IFNα memerlukan penelitian lebih lanjut.Selain itu, kami juga menemukan bahwa MX1 berinteraksi dengan IFIT3 dan DDX60 di ketiga pengulangan yang diberi perlakuan IFNα (Gbr. S2C).
DDX60 adalah helicase sitoplasma yang diinduksi IFN yang sebelumnya telah dilaporkan berperan dalam degradasi virus RNA46 yang independen terhadap RIG-I.Ia berinteraksi dengan RIG-I dan mengaktifkan pensinyalannya dengan cara khusus ligan 46. DDX60 terdiri dari domain helicase DEXD/H-Box dan domain helicase terminal-C yang mengikat RNA virus dan DNA47.Sebagian besar interaksinya dengan MX1 dan IFIT3 terjadi dalam wilayah terminal N dan C yang panjang tanpa domain atau motif kanonik (Gbr. S2E,F).Namun, MX1 juga dikaitkan dengan domain helicase DEXD/H-Box (Gbr. S2E).Protein dari keluarga IFIT memiliki salinan tandem motif heliks-turn-heliks khas yang disebut pengulangan tetrapeptida (TPR).IFIT3 ditemukan sebagai modulator positif dari sinyal RIG-I dan karenanya merupakan komponen kompleks MAVS.Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa IFIT3 dan DDX60 berinteraksi terutama di wilayah antara TPR 3–6 dari IFIT3 dan mungkin berperan dalam pensinyalan RIG-I/MAVS (Gbr. S2F).
Mengingat bahwa penyaringan seluruh proteom memerlukan komputasi yang intensif, kami kemudian menyaring seluruh database UniProt manusia untuk mengetahui keberadaan salah satu pengulangan yang diobati dengan IFNα.Dalam replika ini, kami menemukan beberapa jaringan interaksi yang sangat andal untuk HLA-A.Analisis jalur protein yang diidentifikasi oleh spektrum MS/MS menunjukkan bahwa pemrosesan dan presentasi antigen berbasis MHC-I adalah jalur utama yang diinduksi oleh interferon (Gambar 3D).Oleh karena itu, kami fokus mempelajari interaksi protein molekul MHC-I dengan tingkat kepercayaan yang tinggi pada semua sampel ikatan silang.HLA terdiri dari domain α1, α2 dan α3 serta rantai ringan, dan mikroglobulin β2 (β2m) adalah protein pendamping yang konstan49.Setelah berkumpul di retikulum endoplasma, HLA menjadi tidak stabil tanpa adanya ligan peptida50.Alur pengikatan peptida dibentuk oleh domain α1 dan α2 yang sangat polimorfik dan tidak terstruktur dalam bentuk non-peptida dan domain α351 yang relatif kurang polimorfik.Di hadapan IFNα, kami mendeteksi dua kompleks HLA-A: satu berinteraksi dengan HMGA1 dan H2B (Gambar 5, Tabel S3) dan yang lainnya berinteraksi dengan MDN1, LRCH4 dan H2B (Gambar 6).
IFNα menginduksi jaringan interaksi HLA-A dengan H2B (H2BFS) dan HMGA1.(A) Plot 2D (dihasilkan dalam perangkat lunak SIM-XL) yang menggambarkan berbagai jenis interaksi dalam kompleks H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (biru), interlink (merah) dan single link (hitam)..Domain dengan identitas berbeda diberi kode warna32: H2B (histone; 2–102) dan MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 dan MHC_I_C; 337–364).Ambang batas tautan silang ditetapkan sebesar 3,5.Plot titik menunjukkan situs interaksi HLA-A dengan H2B (B) dan HMGA1 (C), serta situs interaksi K atau S antara kedua peptida.Pada gambar, ambang batas skor tautan silang ditetapkan ke 3,0.(D) Hubungan antar protein ditunjukkan pada struktur protein H2B, HLA-A, dan HMGA1 pada program PyMOL.Struktur ini dimodelkan menggunakan server Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) dan struktur templat untuk protein H2B, HLA-A dan HMGA1 masing-masing adalah 1kx552, 1kj349 dan 2eze55.
IFNα menginduksi jaringan interaksi HLA-A dengan H2B (H2BFS), MDN1 dan LRCH4.(A) Tautan silang intramolekul (merah) dan antarmolekul (biru) disajikan pada peta interaktif 2D (dihasilkan dalam perangkat lunak SIM-XL) dengan MDN1 direpresentasikan sebagai lingkaran.Ambang batas tautan silang ditetapkan sebesar 3,5.Domain dengan identitas berbeda diberi kode warna32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 dan MHC_I_C; 337–364) dan LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) dan CH (535–641)).(B) Hubungan antar protein ditunjukkan pada struktur protein H2B, HLA-A, LRCH4, dan MDN1 pada program PyMOL.Struktur ini dimodelkan menggunakan server Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) dengan struktur templat 1kx552, 1kj349, 6hlu62 dan 6i2665 untuk protein H2B, HLA-A, LRCH4 dan MDN1, masing-masing.Plot titik menunjukkan situs interaksi K atau S untuk HLA-A dengan H2B (C), LRCH4 (D), dan MDN1 (E).Untuk plot, ambang batas skor tautan silang ditetapkan ke 3,0.
Selain menjaga integritas genom, histone H2B juga terlibat dalam regulasi transkripsi.Protein H2B terdiri dari domain histon sentral (HFD) yang dibentuk oleh tiga heliks α yang dipisahkan oleh loop dan ekor terminal-C 41,52.Sebagian besar interaksi dengan H2B terjadi pada heliks α1, yang menyediakan trimerisasi dengan heterodimer HFD (Gbr. 5A,B).Meskipun lisin terlibat dalam pengikatan DNA, beberapa lisin juga merupakan tempat asetilasi atau metilasi alternatif.Misalnya, residu K43, K46, dan K57 dari H2B tidak terlibat dalam pengikatan DNA langsung, namun merupakan target dari berbagai modifikasi pasca-transkripsi53.Demikian pula, residu K44, K47, dan K57 dalam H2B mungkin memainkan peran alternatif dengan adanya IFNα, termasuk interaksi dengan protein lain (Gambar 5A, B).Selain itu, histone ekstrachromosomal H2B mengaktifkan respon imun di berbagai tipe sel, bertindak sebagai sensor sitosol untuk mendeteksi fragmen DNA beruntai ganda (dsDNA) yang berasal dari agen infeksi atau sel yang rusak54.Dengan adanya virus DNA, penipisan H2B menghambat produksi IFN-β dan fosforilasi STAT154.H2B juga diketahui bergerak masuk dan keluar inti lebih cepat dibandingkan histon inti lainnya54.Interaksi H2B dengan MDN1 dan LRCH4 juga diamati pada sampel terpilih yang tidak diobati.Kami menemukan bahwa HLA-A berinteraksi dengan H2B di ketiga sampel yang diberi perlakuan IFNα dan dalam satu sampel berulang yang tidak diberi perlakuan.Data ini mencerminkan peran H2B dalam fungsi fisiologis alternatif yang tidak bergantung pada regulasi transkripsional.
HMGA1 (kelompok mobilitas tinggi AT-Hook 1), sebuah nukleoprotein kecil yang kaya akan asam amino pemicu penyakit, telah diidentifikasi terkait dengan HLA-A.Ia memiliki ekor terminal-C yang bersifat asam dan tiga DBD berbeda yang disebut kait AT karena mereka mengikat alur kecil di wilayah kaya AT di dsDNA55,56.Pengikatan ini menyebabkan DNA membengkok atau meluruskan, memungkinkan faktor transkripsi kanonik mengakses urutan konsensusnya.Ekor terminal-C diyakini terlibat dalam interaksi protein-protein dan rekrutmen faktor transkripsi, karena mutan penghapus terminal-C tidak dapat memulai transkripsi57.Selain itu, domain ini berisi beberapa situs fosforilasi yang dilestarikan yang dikenal sebagai substrat untuk kinase 58 .Kami mengamati interaksi HLA-A dan H2B dengan HMGA1 di luar domain C-terminal, menunjukkan bahwa domain C-terminal terutama digunakan untuk pengikatan faktor transkripsi (Gambar 5A, C).Protein HMGA bersaing dengan histone H1 untuk mengikat DNA adaptor, sehingga meningkatkan aksesibilitas57.Demikian pula, nampaknya HMGA berinteraksi dengan histone H2B sepanjang DNA penghubung dalam persaingan dengan histone H1.HMGB1 menginduksi ekspresi HLA-A, -B, dan -C dalam sel dendritik, yang menyebabkan aktivasinya59, namun interaksi antara HMG dan HLA belum pernah dilaporkan sebelumnya.Kami menemukan bahwa HMGA1 berinteraksi dengan domain α1 dan α3 HLA-A, dengan sebagian besar interaksi di luar 3 DBD-nya (Gambar 5A,C).Di tangan kami, HLA-A ditemukan terlokalisasi di dalam nukleus (data tidak ditampilkan), dan mengingat H2B dan HMGA1 juga terdapat di dalam nukleus, interaksi ini kemungkinan besar terjadi di dalam nukleus.Hasil tambahan spesifik yang diukur antara H2B, HLA-A, dan HMGA1 ditunjukkan pada Gambar 5D.
Sebagian besar interaksi HLA-A dengan protein lain terjadi dalam domain α1 dan α2 dan domain terminal C yang tidak teratur (Gbr. 6).Dalam salah satu contoh ini, kami menemukan bahwa HLA-A berinteraksi dengan ekor N-terminal LRCH4 yang tidak teratur (Gambar 6A,D).LRCH4 mengatur aktivasi TLR4 dan induksi sitokin LPS, sehingga memodulasi respon imun bawaan60,61.Ini adalah protein membran dengan sembilan pengulangan kaya leusin (LRR) dan motif homologi calmodulin (CH) dalam ektodomainnya, diikuti oleh domain transmembran (TMD) 60, 62.Domain CH telah dilaporkan memediasi interaksi protein-protein 60 .Bentangan sekitar 300 asam amino antara domain LRR dan CH relatif dapat diakses tetapi tidak teratur.Berdasarkan fungsi daerah yang tidak teratur sebagai mediator jaringan protein-protein dan transpor vesikular 63, kami menemukan bahwa sebagian besar interaksi protein terjadi di daerah yang tidak teratur.Interaksi dengan MDN1 didistribusikan ke seluruh panjang protein, termasuk domain LRR1, LRR6, CH, dan wilayah acak, sedangkan H2B terutama terikat pada domain CH (Gambar 6A, B).Khususnya, tidak ada interaksi yang melibatkan TMJ, yang menunjukkan kekhususan pendekatan CLMS (Gambar 6A, B).
MDN1 juga telah diidentifikasi sebagai bagian dari jaringan protein HLA-A (Gambar 6A).Itu milik keluarga protein AAA (ATPase yang terkait dengan aktivitas berbeda).Ini adalah domain AAA terminal-N yang sama yang disusun menjadi cincin heksamerik dan menghilangkan faktor perakitan dari subunit ribosom 60S 64.tampaknya mirip dengan dynein64,65,66.Selain itu, wilayah kaya Asp/Glu diikuti oleh domain MIDAS (situs yang bergantung pada ion logam).Karena ukuran MDN1 yang besar (kira-kira 5600 asam amino) dan homologinya yang terbatas dengan protein yang telah dipelajari dengan baik, sedikit yang diketahui tentang struktur dan fungsinya pada manusia.Kami mengidentifikasi HLA-A, H2B, dan LRCH4 sebagai mitra pengikatan MDN1 dan mengungkapkan orientasi mereka sebagai kompleks protein di PyMol (Gambar 6A,B).Ketiga protein ini berinteraksi dengan domain AAA, domain penghubung mirip dynein, dan mungkin domain MIDAS MDN1.Dalam laporan sebelumnya, pemurnian afinitas protein umpan mengidentifikasi MDN1 sebagai protein yang terkait dengan histone H2B67.Selain itu, penelitian terbaru juga melaporkan interaksi antara MDN dan HLA-B dalam sel HCT116 menggunakan spektrometri massa yang dimurnikan afinitas, mendukung temuan kami68.Identifikasi kompleks ini dalam sampel yang diberi IFNα menunjukkan peran MDN1 dalam pensinyalan interferon.
Karena gen HLA sangat polimorfik, kami mengekstraksi sekuensing membaca pemetaan HLA-A, -B, dan -C dari data sekuensing RNA sel Flo-1 (data tidak ditampilkan).Urutan peptida yang konsisten dengan pembacaan sekuensing menunjukkan perbedaan yang signifikan antara HLA-A, -B, dan -C di wilayah di mana peptida ikatan silang berada di HLA-A (Gambar S3).Selain itu, kami tidak mengamati hubungan silang protein-ke-protein dari molekul HLA-B/C dengan protein H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Hal ini menunjukkan bahwa interaksi protein yang ditemukan antara HLA-A, MDN1, LRCH1 dan HMGA1 bersifat spesifik HLA-A.Selain itu, analisis proteomik sampel yang tidak berikatan silang (Tabel S4) menunjukkan bahwa HLA-A memiliki cakupan urutan yang lebih tinggi dibandingkan dengan HLA-B atau HLA-C.Peptida yang diidentifikasi untuk HLA-A memiliki intensitas tinggi pada sampel yang diberi perlakuan IFNα dan tidak.
Untuk memastikan bahwa interaksi yang diidentifikasi di sini bukan disebabkan oleh hubungan silang non-spesifik dari dua protein dalam jarak dekat, kami selanjutnya mengkonfirmasi dua faktor interaksi HLA-A baru dengan melakukan uji ko-imunopresipitasi.Interaksi HLA-A dengan MDN1 dan H2B endogen terdeteksi pada sel Flo-1 yang diobati dengan IFNα dan tidak diobati (Gambar 7, Gambar S4).Kami mengkonfirmasi bahwa HLA-A ditangkap oleh H2B dalam imunopresipit dan bahwa hubungan ini disebabkan oleh pengobatan IFNα karena HLA-A tidak ada dalam sampel imunopresipit dari sel yang tidak diobati (Gambar 7A).Namun, data kami menunjukkan bahwa IFNα secara berbeda mengatur pengikatan HLA-A terhadap H2B dan MDN1.IFNα menginduksi hubungan antara H2B dan HLA-A, tetapi mengurangi hubungannya dengan MDN1.Kami menemukan bahwa MDN1 dikaitkan dengan HLA-A pada kontrol, dan penambahan IFNα mengurangi interaksi ini terlepas dari induksi MDN1 oleh IFNα (Gambar 7B,C).Selain itu, imunopresipitasi HLA-A menangkap H2B dalam sel A549 (Gambar S4), menunjukkan bahwa interaksi ini tidak tergantung pada tipe sel.Secara keseluruhan, hasil ini mendukung interaksi HLA-A yang dimediasi interferon dengan H2B dan MDN1.
HLA-A memurnikan H2B dan MDN1.Immunoblot H2B (A) dan MDN1 (B) endogen yang representatif di imunopresipitasi dari sel Flo-1 yang diobati dengan IFNα dan diperiksa untuk antibodi yang ditunjukkan.IgG tikus dan kelinci digunakan sebagai kontrol negatif.(C) Jumlah relatif (masukan) dari antigen yang berbeda digambarkan oleh imunoblot yang diperiksa terhadap antibodi yang ditunjukkan, β-aktin digunakan sebagai kontrol pemuatan.
Sifat struktural dari salah satu jaringan cross-linked yang sangat andal yang diinduksi interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, diselidiki.Kami menggunakan pemodelan dinamika molekuler sebagai pendekatan alternatif untuk memahami dinamika konformasi protein yang terlibat dalam kompleks ini (Gambar 8).Kesimpulan dari data CLMS menunjukkan kemungkinan perbedaan konformasi protein H2B, HLA-A, dan HMGA1.Oleh karena itu, kompleks potensial berikut dimodelkan dalam media pelarut: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, dan H2B-HLA-A-HMGA1.Layar docking protein-protein awal menggunakan paket MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) menyarankan kemungkinan konformasi yang berbeda antara protein-protein ini (Gbr. 8A).Visualisasi kompleks protein docking mengungkapkan beberapa interaksi dan kemungkinan konformasi (Gambar 5A, 8).Dengan demikian, satu kemungkinan konformasi ditunjukkan pada Gambar 8A (dengan tautan silang berlabel) dan selanjutnya dievaluasi menggunakan pipa pemodelan MD.Selain itu, pengikatan H2B atau HMGA1 ke HLA-A menyoroti afinitas H2B yang lebih tinggi terhadap HLA-A (Gbr. 8A).
Dinamika konformasi jaringan yang mungkin antara kompleks H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, dan H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Panel kiri adalah peta 2D (dihasilkan dalam perangkat lunak SIM-XL) dari ikatan silang intramolekul (merah) dan antarmolekul (biru) (batas ikatan silang diatur ke 3,5).Selain itu, residu ikatan silang yang diidentifikasi diberi label pada struktur protein H2B, HLA-A, dan HMGA1.Konformasi terkait protein ini diekstraksi menggunakan pipa docking yang diterapkan dalam paket MOE.Panel kiri bawah menunjukkan berbagai kemungkinan konformasi kompleks H2B-HLA-A dan HMGA1-HLA-A dengan afinitas pengikatan protein-protein yang berbeda (GBVI/WSA dG; kkal/mol).(B) Standar deviasi (RMSD) posisi atom (tidak termasuk atom hidrogen) untuk setiap struktur protein.(C) Interaksi ikatan hidrogen protein-protein antarmolekul dari berbagai kompleks yang disimulasikan dengan mempertimbangkan interaksi spesifik dengan durasi ≥ 10 ns.Jarak cutoff donor-akseptor ikatan-h ditetapkan pada 3,5 Å, dan sudut cutoff donor-H-akseptor ditetapkan pada ≥ 160°–180°.(D) Residu berlabel yang membentuk interaksi protein-protein HLA-A dengan pasangannya masing-masing, dengan rentang ≥ 20 ns, diekstraksi dari kompleks tiruan HLA-A-H2B dan HLA-A-HMGA1.Struktur protein mewakili struktur rata-rata 100 ns MDS.(E) Interaksi antara kompleks HLA-A-H2B dan HLA-A-HMGA1 dibandingkan dengan interaksi yang dilacak oleh simulasi H2B-HLA selama 100 ns berdasarkan situs interaksi K atau S antara dua peptida.Kompleks /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Nilai ambang batas untuk evaluasi ikatan silang ditetapkan ke 3,0, dan interaksi spesifik dari MDS yang menggunakan ≥ 10 ns diperhitungkan.Struktur protein divisualisasikan menggunakan paket BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) dan Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabilitas molekul HLA-A dari waktu ke waktu (deviasi standar; RMSD atau deviasi standar; RMSF) menunjukkan bahwa keberadaan protein H2B atau HMGA1 dalam kompleks menstabilkan HLA-A (Gambar 8B, Gambar S5).Protein HMGA1 berikatan erat dengan situs B2M HLA-A, menginduksi stabilitas asam amino HLA-A di kompleks HLA-A-HMGA1 atau H2B-HLA-A-HMGA1 (Gambar 8B, Gambar S5).khususnya, residu HLA ~60-90 dan ~180-210 ditemukan kurang fleksibel dengan adanya H2B (Gbr. 8B).H2B dan HMGA1 menunjukkan pengikatan yang lebih baik terhadap HLA-A di kompleks H2B-HLA-A-HMGA1 dibandingkan dengan pengikatan HLA-A pada H2B atau HMGA1 saja (Gambar 8C,D; Tabel S5).Residu yang terlibat dalam ikatan hidrogen (okupansi tinggi model MD ≥ 10 ns) bertepatan dengan situs interaksi CLMS (residu K atau S) di kompleks, menunjukkan bahwa interaksi yang diidentifikasi oleh CLMS sangat dapat diandalkan.Keandalan (Gbr. 8E).Dalam pemodelan CLMS dan MD, residu HLA-A antara sekitar 190-210 dan sekitar 200-220 asam amino ditemukan masing-masing mengikat H2B dan HMGA1 (Gbr. 8E).
Interaksi protein-protein membentuk jaringan struktural dinamis yang memediasi komunikasi intraseluler sebagai respons terhadap rangsangan tertentu.Karena banyak pendekatan proteomik mendeteksi perubahan tingkat tunak keseluruhan suatu protein, dinamika interaksi protein-protein memerlukan alat tambahan untuk menangkap antarmuka pengikatan, dan CLMS adalah salah satu alat tersebut.Sistem pensinyalan interferon adalah jaringan sitokin yang memungkinkan sel merespons serangkaian sinyal patologis patogenik dan intrinsik lingkungan, yang berpuncak pada induksi subset protein yang diinduksi interferon.Kami menerapkan CLMS untuk menentukan apakah interaksi protein-protein baru dapat diidentifikasi di antara panel protein yang diinduksi interferon.Analisis ikatan silang protein global dalam model sel Flo-1 yang responsif terhadap interferon digunakan untuk menangkap kompleks protein.Ekstraksi peptida tryptic dari sel non-cross-linked dan cross-linked memungkinkan penghitungan peptida, pengayaan jalur, dan distribusi panjang peptida dengan intensitas LFQ yang ditentukan.Protein yang diinduksi interferon kanonik diidentifikasi sebagai kontrol internal positif, sementara tambahan ikatan silang antarmolekul dan intramolekul baru dari protein yang diinduksi interferon kanonik seperti MX1, UP18, OAS3 dan STAT1 diamati.Berbagai fitur struktural dan interaksi di area fungsional telah diselidiki.
Interaksi antara HLA-A, MDN1 dan H2B dideteksi dengan immunoblotting pada sel Flo-1 dan A549 yang diobati dan tidak diobati dengan IFNα.Hasil kami menyoroti bahwa HLA-A kompleks dengan H2B dengan cara yang bergantung pada IFNα.Pekerjaan kami mewakili jalan yang menarik untuk eksplorasi lebih lanjut mengenai ko-lokalisasi kedua kompleks ini.Menarik juga untuk memperluas pendekatan CLMS ke panel garis sel untuk mengidentifikasi interaksi protein yang dimediasi interferon yang tidak bergantung pada tipe sel.Akhirnya, kami menggunakan pemodelan MD sebagai pendekatan alternatif untuk memahami dinamika konformasi protein yang terlibat dalam kompleks H2BFS-HLA-A-HMGA1, yang melacak pembicaraan silang intramolekul dan antarmolekul.Kesimpulan dari data CLMS menunjukkan kemungkinan konformasi berbeda dari protein H2BFS, HLA-A, dan HMGA1.Kemungkinan konformasi berbeda antara kompleks protein docking ini mengungkapkan beberapa interaksi serupa dengan yang diamati pada dataset CLMS.Salah satu kekuatan utama metode kami adalah memungkinkan identifikasi yang mudah dari interaksi gen yang sangat polimorfik seperti HLA, sehingga akan menarik untuk mempelajari interaksi protein spesifik haplotipe HLA yang sulit dipelajari.Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa CLMS dapat digunakan untuk memperluas pemahaman kita tentang jaringan sinyal yang diinduksi interferon dan memberikan dasar untuk mempelajari sistem antar sel yang lebih kompleks dalam lingkungan mikro tumor.
Sel Flo-1 diperoleh dari ATCC dan disimpan dalam DMEM (Gibco) yang ditambah dengan 1% penisilin/streptomisin (Invitrogen), 10% serum janin sapi (Gibco) dan disimpan pada suhu 37°C dan 5% CO2.Inkubasi.Sel ditumbuhkan hingga pertemuan 70-80% sebelum diobati dengan IFNα14 (diproduksi oleh Fasilitas Produksi Protein Edinburgh).Semua bahan kimia dan reagen lainnya dibeli dari Sigma Aldrich kecuali dinyatakan lain.
Sel Flo-1 dikultur dalam pelat 6 sumur dan hari berikutnya sel diberi 10 ng/ml IFNα14 selama 24 jam hingga pertemuan sekitar 80%.Sel dicuci tiga kali dengan PBS dan diikat dengan DSS (Thermo Fisher Scientific) yang baru disiapkan (dilarutkan dalam DMSO) dalam PBS selama 5 menit pada suhu 37°C hingga konsentrasi akhir 0,5 mM.Reaksi pengikatan silang DSS diganti dengan PBS dan sisa DSS didinginkan dengan menambahkan 20 mM Tris (pH 8,0) dalam PBS selama 15 menit pada suhu 37°C.Sel dikumpulkan dengan cara dikikis dan dikumpulkan dalam tabung pengikat rendah (Axygen).
Pelet sel dilisiskan dengan 300 μl buffer lisis urea (urea 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) selama 30 menit pada suhu kamar dengan pengocokan sesekali.Semua langkah sentrifugasi dilakukan pada 14.000 xg pada suhu 8°C.Sentrifugasi lisat selama 10 menit dan pindahkan supernatan ke tabung baru.Partikel bening yang tersisa dilarutkan dalam 150 μl buffer lisis kedua (2 M urea, 2% (b/v) SDS (natrium dodesil sulfat)) selama 30 menit atau lebih sampai diperoleh larutan berair homogen.Lisat disentrifugasi selama 20 menit dan supernatan dicampur dengan lisat yang diperoleh pada langkah sebelumnya.Konsentrasi protein dinilai menggunakan uji Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) sesuai dengan instruksi pabrik untuk prosedur lempeng mikro.Sampel segera dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -80°C.
Sekitar 100 μg protein ikatan silang terlarut diproses menggunakan protokol persiapan sampel filtrasi yang dimodifikasi (FASP) seperti yang dijelaskan oleh Wisniewski et al.69 Secara singkat, protein diikat silang dengan 200 μl buffer urea (8 M urea dalam 0,1 M Tris, pH 8,5), divorteks dan dibelah dua.Semua langkah sentrifugasi dilakukan pada 14.000 xg pada suhu 25°C.Paruh pertama protein lisat ikatan silang dipindahkan ke perangkat filter sentrifugal Microcon 10 kDa yang dilengkapi dengan membran Ultracel-10 (Merck), diikuti dengan sentrifugasi pada filter selama 25 menit.Kemudian tambahkan bagian kedua protein ke dalam filter dan ulangi langkah yang sama.Pemulihan protein dilakukan dengan menambahkan 100 μl 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) dalam buffer urea.Pemulihan diaduk pada thermomixer dengan kecepatan 600 rpm selama 30 menit pada suhu 37°C.Selain itu, kolom disentrifugasi dan protein ikatan silang tereduksi dialkilasi menggunakan 100 μl iodoacetamide 50 mM dalam buffer urea.Reaksi alkilasi dilakukan pada suhu kamar selama 20 menit dalam ruangan gelap.Putar kolom, cuci dinding kolom 3 kali dengan 100 µl urea buffer, lalu sentrifugasi.Operasi yang sama dilakukan 3 kali menggunakan 100 μl 100 mM amonium bikarbonat.Sebelum trypsinisasi, ganti tabung pengumpul dengan yang baru.Tambahkan buffer pencernaan yang mengandung 50 mM amonium bikarbonat dan 1 μl trypsin yang diencerkan dalam buffer trypsin (Promega).Rasio trypsin terhadap protein dipertahankan pada sekitar 1:33, dan reaksi pencernaan diinkubasi semalaman pada suhu 37°C dalam ruang lembab.Peptida berikatan silang dielusi dari filter dengan sentrifugasi selama 25 menit.Pemulihan peptida ditingkatkan dengan menambahkan 50 μl NaCl 0,5 M ke dalam filter, diikuti dengan sentrifugasi selama 25 menit.
Kolom Micro Spin C18 (Harvard Apparatus) digunakan untuk menghilangkan garam peptida tryptic ikatan silang mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Bouchal dkk.70 dengan sedikit modifikasi.Secara singkat, kolom putar C18 diaktifkan dengan tiga kali pencucian dengan asam format (FA) 0,1% dalam asetonitril (AcN) (Merck) dan dua kali pencucian dengan FA 0,1%.Kolom dihidrasi dengan FA 0,1% selama 15 menit.Masukkan sampel ke dalam kolom putar dan cuci 3 kali dengan FA 0,1%.Peptida yang dihilangkan garamnya dielusi secara berurutan dengan gradien bertahap menggunakan 50%, 80% dan 100% AcN dalam 0,1% FA.Sampel dikeringkan dalam konsentrator SpeedVac Plus (Eppendorf) hingga sisa cairan benar-benar hilang.Peptida yang dielusi dilarutkan dalam 100 μl asam trifluoroasetat 0,08% dalam 2,5% AcN dan konsentrasinya diukur pada NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Sekitar 1 μg peptida berikatan silang per sampel disuntikkan ke dalam sistem LC-MS/MS.
Peptida berikatan silang dipisahkan pada sistem UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) yang terhubung ke spektrometer massa Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptida berikatan silang dikumpulkan pada ID 300 µm, kolom penangkap C18 µ-pra-kolom panjang 5 mm yang dikemas dengan sorben C18 PepMap100 dan sorben PepMap 5 µm (Thermo Scientific).Muat aliran pompa yang disetel pada 5 µl/mnt asam trifluoroasetat 0,08% yang dilarutkan dalam 2,5% AcN.Peptida berikatan silang dipisahkan pada kolom silika leburan analitik dengan diameter dalam 75 μm dan panjang 150 mm, diisi dengan sorben PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Fase gerak A dan B masing-masing terdiri dari 0,1% FA dalam air dan 0,1% FA dalam asetonitril.Gradien dimulai dari 2,5% B dan meningkat secara linier hingga 40% B selama 90 menit, lalu menjadi 90% B selama 2 menit berikutnya.Komposisi fase gerak dipertahankan pada 90% B selama 10 menit dan kemudian diturunkan secara linier menjadi 2,5% B selama 2 menit.Kolom diseimbangkan pada 2,5% B selama 8 menit sebelum siklus berikutnya.Peptida berikatan silang yang dielusi dari kolom analitik diionisasi dalam sumber ionisasi nanoelectrospray (NSI) dan disuntikkan ke dalam spektrometer massa Exploris 480 (Thermo Scientific).
Spektrometer massa Orbitrap Exploris 480 beroperasi dalam mode korelasi data positif.Pemindaian penuh dilakukan dalam mode bagian pada resolusi 120.000 dengan pengaturan rentang dari m/z 350 Th hingga m/z 2000 Th.Target AGC yang dinormalisasi ditetapkan sebesar 300% dengan waktu input maksimum 50 ms.Deteksi puncak monoisotopik telah dilakukan untuk peptida.Parameter pelonggaran batasan disetel ke true jika terlalu sedikit prekursor yang ditemukan.Kekuatan ionik minimum prekursor ditetapkan ke 5.0e3 dan status muatan prekursor hingga +8 dimasukkan dalam percobaan.
Waktu siklus antara pemindaian besar dalam mode korelasi data diatur ke 2,5 detik.Pengecualian massa dinamis diatur ke 20 detik setelah fragmentasi pertama ion prekursor.Jendela isolasi prekursor diatur ke 2 Th.Jenis energi tumbukan yang dinormalisasi dengan mode energi tumbukan tetap dipilih dalam pemindaian MS/MS yang bergantung pada data.Energi tabrakan disetel ke 30%.Resolusi Orbitrap ditetapkan ke 15.000 dan target AGC menjadi 100%.Waktu injeksi maksimum khusus diatur ke 60 milidetik.
Sebelum melacak jaringan protein-protein dalam sampel ikatan silang, kami memproses file mentah menggunakan paket MaxQuant (versi 1.6.12.0)26,27 untuk mengidentifikasi peptida/protein yang dapat dilacak dalam sampel.Selain itu, analisis proteomik serupa dilakukan pada sampel Flo-1 yang tidak berikatan silang yang diberi dan tidak diberi IFNα.Data MS/MS dicari di database manusia UniProt (www.uniprot.org) (diunggah 12 Agustus 2020, berisi 75.093 entri) menggunakan mesin pencari bawaan Andromeda27.Pencarian dilakukan tanpa menunjukkan spesifisitas enzim dan berbagai modifikasi deamidasi (N,Q) dan oksidasi (M).Toleransi massa prekursor ditetapkan pada 20 ppm dan ion produk pada 0,02 Da.Deviasi massa awal dan maksimum ditetapkan sebesar 10 ppm.Massa maksimum peptida ditetapkan pada 4600 Da dan kesamaan urutan ditetapkan antara 7 dan 25 asam amino (aa).Analisis statistik lebih lanjut dilakukan dengan menggunakan program Perseus (versi 1.6.10.45).Kandungan protein dihitung dengan menormalkan intensitas spektral protein (intensitas LFQ; kuantifikasi tanpa label) dan nilai intensitas dikonversi ke Log2.Pengelompokan hierarki protein yang diidentifikasi berdasarkan intensitas peptidanya dibangun menggunakan paket pheatmap (v1.0.12) di R (v 4.1.2).Analisis pengayaan jalur dilakukan dengan menggunakan database jalur Reactome untuk protein yang diberi perlakuan IFNα yang lebih dari empat kali diaktifkan dibandingkan dengan sampel yang tidak diberi perlakuan.
Identifikasi ikatan silang kimia spesifik lisin (K) atau serin (S) dari kompleks protein yang dipantau oleh LC-MS/MS dilakukan dengan menggunakan mesin identifikasi spektroskopi (SIM-XL) untuk peptida ikatan silang (SIM-XL)29.Pertama, kemungkinan interaksi antara gen tanda tangan ketahanan kerusakan DNA (IRDS) yang terkait dengan interferon (IFN) diselidiki menggunakan kumpulan data protein IRDS yang dijelaskan dalam Padariya dkk.28.Menyaring semua kondisi dan pengulangan seluruh UniProt manusia memerlukan komputasi yang intensif, sehingga seluruh database UniProt manusia (www.uniprot.org) (diunduh pada 12 Agustus 2020, berisi 75.093 entri) terhadap pengulangan yang diberi perlakuan IFNα.Salah satu filter untuk interaksi kepercayaan tinggi.Interaksi dengan signifikansi tinggi yang diperoleh ini diperluas dan diuji di semua pengulangan dan kondisi.
Di SIM-XL, DSS digunakan untuk crosslinker (XL) dan pergeseran bobot XL serta pergeseran bobot modifikasi ditetapkan masing-masing ke 138,06 dan 156,07.Situs reaksi ikatan silang berikut dipertimbangkan: KK, KS dan KN-TERM, tanpa ion reporter.Ppm prekursor dan fragmen ditetapkan ke 20 dan ambang batas Xrea ditetapkan ke 0,15.Tripsin dianggap sangat spesifik, dan metode fragmentasi C-trap (HCD) energi tinggi diterapkan.Ambang batas pengurangan DB dinamis XCorr dan jumlah minimum peptida untuk pengurangan DB dinamis ditetapkan masing-masing menjadi 2,5 dan 2.Parameter lainnya adalah: probabilitas monoisotop dan cutoff kebetulan puncak, minimum 4 residu AA per untai dan muatan untai maksimum, dan maksimal 3 pemisahan yang terlewat.Peta 2D gabungan yang dihasilkan dianalisis dalam (SIM-XL) dan representasi grafis xQuest28 digunakan untuk membuat peta 2D.Tautan silang protein pada struktur protein disediakan di PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versi 2.0 Schrödinger, LLC).
Struktur model protein dibuat menggunakan server Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 menggunakan prinsip pemodelan homologi dan implementasi “Metode Markov Tersembunyi”.Phyre2 menghasilkan struktur model berdasarkan penyelarasan urutan dengan struktur protein yang diketahui.Untuk protein H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, dan MDN1, struktur templat 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, dan 6i2665 digunakan.Selain itu, struktur AlphaFold71 MX1, UBP18 dan ROBO1 juga dipertimbangkan.Struktur protein divisualisasikan menggunakan paket BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) dan paket Lingkungan Operasi Molekuler (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).