347 Tabung melingkar baja tahan karat 12,7*1,24mm, Mekanisme molekul kondensasi elektrostatik sinkron dan koagregasi α-synuclein dan tau

Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Slider menampilkan tiga artikel per slide.Gunakan tombol kembali dan berikutnya untuk menelusuri slide, atau tombol pengontrol slide di akhir untuk menelusuri setiap slide.

Spesifikasi Pipa Stainless Steel 347

347 Tabung melingkar baja tahan karat 12,7*1,24mm

Diameter Luar: OD 6,00 mm hingga OD 914,4 mm, Ukuran hingga 24” NB tersedia Ex-stock, Tersedia Tabung Baja Ukuran OD Ex-stock

Kisaran Ketebalan Pipa SS 347 : 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, dll. (0,5-12mm) Atau ukuran non-reguler dapat disesuaikan sesuai kebutuhan

Tipe : Pipa Seamless SS 347 |Pipa SS 347 ERW |Pipa Las SS 347 |Pipa Fabrikasi SS 347 |Tabung SS 347 CDW, Pipa LSAW / Dilas Jahitan / Digambar Ulang

Bentuk: Pipa/Tabung Bulat SS 347, Pipa/Tabung Persegi SS 347, Pipa/Tabung Persegi Panjang SS 347, Tabung Melingkar SS 347, Bentuk “U” SS 347, Kumparan Pan Cake SS 347, Tabung Hidrolik SS 347

Panjang: Acak Tunggal, Acak Ganda & Panjang yang Diperlukan Ujung: Ujung Polos, Ujung Miring, Bertapak

Perlindungan Akhir: Tutup Plastik |Selesai Luar: 2B, No.4, No.1, No.8 Cermin Selesai untuk Pipa Stainless Steel, Selesai sesuai Kebutuhan pelanggan

Kondisi Pengiriman: Anil dan Acar, Dipoles, Anil Cerah, Ditarik Dingin

Inspeksi, Laporan Uji: Sertifikat Uji Pabrik, EN 10204 3.1, Laporan Kimia, Laporan Mekanis, Laporan Uji PMI, Laporan Inspeksi Visual, Laporan Inspeksi Pihak Ketiga, Laporan Lab yang Disetujui NABL, Laporan Uji Merusak, Laporan Uji Tak Merusak

Pengepakan: Dikemas dalam Kotak Kayu, Kantong Plastik, Strip Baja yang Dibundel, atau sesuai Permintaan Pelanggan

Spesial: Ukuran dan Spesifikasi selain di atas dapat diproduksi berdasarkan permintaan

Kisaran Ukuran Pipa SS 347: NB 1/2 inci, OD hingga 24 inci

ASTM A312 347: Pipa austenitik mulus dan jahitan lurus yang ditujukan untuk suhu tinggi dan layanan korosif umum.Logam pengisi tidak diperbolehkan selama pengelasan.

ASTM A358 347: Pipa austenitik las fusi listrik untuk layanan korosif dan/atau suhu tinggi.Biasanya hanya pipa hingga 8 inci yang diproduksi dengan spesifikasi ini.Penambahan logam pengisi diperbolehkan selama pengelasan.

ASTM A790 347: Pipa feritik/austenitik (dupleks) mulus dan jahitan lurus yang ditujukan untuk layanan korosif umum, dengan penekanan khusus pada ketahanan terhadap retak korosi tegangan.

ASTM A409 347: Pipa dinding ringan austenitik berdiameter besar yang dilas fusi listrik jahitan lurus atau jahitan spiral dengan ukuran 14” hingga 30” dengan dinding Sch5S dan Sch 10S untuk sifat korosif dan/atau tinggi

ASTM A376 347: Pipa austenitik mulus untuk aplikasi suhu tinggi.

ASTM A813 347: Pipa austenitik jahitan tunggal, las tunggal atau ganda untuk suhu tinggi dan aplikasi korosif umum.

ASTM A814 347: Pipa austenitik yang dilas dengan pengerjaan dingin untuk suhu tinggi dan layanan korosif umum.

Komposisi Kimia Pipa Stainless Steel 347H

Sifat Mekanik Pipa Stainless Steel 347H

Sifat Fisik Pipa Stainless Steel 347H

Nilai Setara untuk Pipa Stainless Steel 347H

Agregasi amyloid alpha-synuclein (αS) adalah ciri khas penyakit Parkinson dan synucleinopathies lainnya.Baru-baru ini, protein tau yang umumnya dikaitkan dengan penyakit Alzheimer telah dikaitkan dengan patologi αS dan ditemukan terkolokalisasi dalam inklusi kaya αS, meskipun mekanisme molekuler koagregasi kedua protein tersebut masih belum jelas.Kami melaporkan di sini bahwa fase αS terpisah menjadi kondensat cair melalui kondensasi kompleks elektrostatik dengan polipeptida bermuatan positif seperti tau.Bergantung pada afinitas αS terhadap polikation dan laju penipisan valensi jaringan koagulasi, bekuan mengalami gelasi atau penggabungan yang cepat diikuti dengan agregasi amiloid yang lambat.Dengan menggabungkan serangkaian teknik biofisik tingkat lanjut, kami dapat mengkarakterisasi pemisahan fase cair-cair αS/Tau dan mengidentifikasi faktor-faktor kunci yang mengarah pada pembentukan agregat heterogen yang mengandung kedua protein dalam kondensat protein cair.
Selain kompartemen membran, pemisahan spasial dalam sel juga dapat dicapai dengan pembentukan benda padat seperti cairan yang kaya protein yang disebut kondensat atau tetesan biomolekuler, melalui proses yang dikenal sebagai pemisahan fase cair-cair (LLPS).Tetesan ini terbentuk oleh interaksi temporal multivalen, biasanya antara protein atau protein dan RNA, dan memiliki berbagai fungsi di hampir semua sistem kehidupan.Sejumlah besar protein berkemampuan LLP menunjukkan rangkaian kompleksitas rendah yang sifatnya sangat tidak teratur dan dalam pembentukan kondensat biomolekuler3,4,5.Sejumlah penelitian eksperimental telah mengungkapkan sifat fleksibel, seringkali tidak teratur, dan multivalen dari protein yang membentuk kondensat yang berbentuk cair ini, meskipun sedikit yang diketahui tentang faktor penentu molekuler spesifik yang mengontrol pertumbuhan dan pematangan kondensat ini menjadi lebih padat. negara..
Data baru ini mendukung hipotesis bahwa LLPS yang digerakkan oleh protein dan transformasi tetesan menjadi struktur padat mungkin merupakan jalur seluler yang relevan yang mengarah pada pembentukan agregat beracun yang tidak larut yang sering menjadi ciri penyakit degeneratif.Banyak protein yang mengalami kelainan intrinsik (IDP) terkait LLPS, seringkali bermuatan tinggi dan fleksibel, telah lama dikaitkan dengan degenerasi saraf melalui proses agregasi amiloid.Secara khusus, kondensat IDP biomolekuler seperti FUS7 atau TDP-438 atau protein dengan domain kompleksitas rendah yang besar seperti hnRNPA19 telah terbukti menua menjadi seperti gel atau bahkan bentuk padat melalui proses yang disebut fluidisasi.menggabungkan.ke transisi fase padat (LSPT) sebagai fungsi waktu atau sebagai respons terhadap modifikasi pasca-translasi tertentu atau mutasi yang signifikan secara patologis1,7.
IDP lain yang terkait dengan LLPS in vivo adalah Tau, protein kelainan terkait mikrotubulus yang agregasi amiloidnya terlibat dalam penyakit Alzheimer10 namun juga baru-baru ini terlibat dalam penyakit Parkinson (PD) dan proteinopati nuklir sinaptik lainnya11, 12, 13 terkait.Tau telah terbukti secara spontan berdisosiasi dari larutan/sitoplasma karena interaksi elektrostatik yang menguntungkan14, menghasilkan pembentukan tetesan yang diperkaya tau yang dikenal sebagai coacervate elektrostatik.Telah diamati juga bahwa jenis interaksi non-spesifik ini merupakan kekuatan pendorong di balik banyaknya kondensat biomolekuler di alam15.Dalam kasus protein tau, agregasi elektrostatik dapat dibentuk melalui agregasi sederhana, di mana daerah protein yang bermuatan berlawanan memicu proses pembelahan, atau dengan agregasi kompleks melalui interaksi dengan polimer bermuatan negatif seperti RNA.
Baru-baru ini, α-synuclein (αS), sebuah IDP amiloid yang terlibat dalam PD dan penyakit neurodegeneratif lainnya yang secara kolektif dikenal sebagai synucleinopathy17,18, telah dibuktikan dalam model seluler dan hewan19,20 terkonsentrasi dalam kondensat protein dengan perilaku seperti cairan.Penelitian in vitro menunjukkan bahwa αS mengalami LLPS melalui agregasi sederhana melalui interaksi yang didominasi hidrofobik, meskipun proses ini memerlukan konsentrasi protein yang sangat tinggi dan waktu inkubasi yang sangat lama19,21.Apakah kondensat yang mengandung αS yang diamati secara in vivo dibentuk oleh proses ini atau proses LLPS lainnya masih menjadi masalah utama yang belum terselesaikan.Demikian pula, meskipun agregasi amiloid αS telah diamati pada neuron di PD dan synucleinopathies lainnya, mekanisme pasti dimana αS mengalami agregasi amiloid intraseluler masih belum jelas, karena ekspresi berlebih dari protein ini tampaknya tidak memicu proses ini dengan sendirinya.Kerusakan sel tambahan sering kali diperlukan, menunjukkan bahwa lokasi seluler atau lingkungan mikro tertentu diperlukan untuk renukleasi kumpulan amiloid αS intraseluler.Salah satu lingkungan seluler yang sangat rentan terhadap agregasi adalah bagian dalam kondensat protein 23 .
Menariknya, αS dan tau telah ditemukan berkolokasi pada inklusi penyakit yang khas pada manusia dengan penyakit Parkinson dan synucleinopathies lainnya 24,25 dan percobaan telah melaporkan hubungan patologis yang sinergis antara kedua protein tersebut 26,27 menunjukkan adanya hubungan potensial antara agregasi αS dan tau pada penyakit neurodegeneratif.penyakit.αS dan tau telah ditemukan berinteraksi dan mendorong agregasi satu sama lain secara in vitro dan in vivo 28,29 dan agregat heterogen yang terdiri dari kedua protein ini telah diamati pada otak pasien dengan synucleinopathy 30 .Namun, sedikit yang diketahui tentang dasar molekuler dari interaksi antara αS dan tau serta mekanisme koagregasinya.αS telah dilaporkan berinteraksi dengan tau melalui tarikan elektrostatis antara wilayah terminal C αS yang bermuatan sangat negatif dan wilayah tau yang kaya akan prolin pusat, yang juga diperkaya dengan residu bermuatan positif.
Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa αS memang dapat berdisosiasi menjadi tetesan melalui kondensasi kompleks elektrostatik dengan adanya protein tau, berbeda dengan interaksinya dengan polipeptida bermuatan positif lainnya seperti poli-L-lisin (pLK), dan dalam proses ini.αS bertindak sebagai molekul perancah untuk jaringan tetesan.Kami telah mengidentifikasi perbedaan nyata dalam proses pematangan coacervate αS elektrostatik, yang terkait dengan perbedaan valensi dan kekuatan interaksi protein yang terlibat dalam jaringan coacervate.Menariknya, kami mengamati koagregasi protein amiloid αS dan tau dalam coacervate cair yang berumur panjang dan mengidentifikasi beberapa faktor kunci yang mengarah pada agregasi bersama kedua protein ini dalam coacervate tersebut.Di sini kami menjelaskan secara rinci proses ini, yang merupakan mekanisme molekuler yang mungkin mendasari kolokalisasi dua protein dalam inklusi spesifik penyakit.
αS memiliki ekor terminal-C yang sangat anionik pada pH netral (Gbr. 1a), dan kami berhipotesis bahwa ia dapat menjalani LLPS melalui kondensasi kompleks elektrostatik dengan molekul polipeptida polikationik yang tidak teratur.Kami menggunakan 100-residu poli-L-lisin (pLK) sebagai molekul model awal karena sifat polimernya yang bermuatan positif dan tidak teratur pada pH netral 32. Pertama, kami memastikan bahwa pLK berinteraksi dengan domain Ct αS melalui spektroskopi Solusi NMR (Gambar 1b) menggunakan αS berlabel 13C/15N dengan adanya peningkatan rasio molar αS:pLK.Interaksi pLK dengan domain Ct αS memanifestasikan dirinya dalam gangguan pergeseran kimia dan penurunan intensitas puncak di wilayah protein ini.Menariknya, ketika kami mencampurkan αS dengan pLK pada konsentrasi αS sekitar.5–25 µM dengan adanya polietilen glikol (5–15% PEG-8) (buffer LLPS tipikal: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) kami segera melalui bidang pembentukan protein yang luas .tetesan diamati menggunakan mikroskop fluoresensi (WF) dan bidang terang (BF) (Gbr. 1c).Tetesan 1-5 µm yang mengandung αS pekat (ditambahkan 1 µM AlexaFluor488 berlabel αS, AF488-αS), sifat elektrostatiknya dapat diperoleh dari ketahanannya terhadap 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) dan sensitivitasnya terhadap peningkatan konsentrasi NaCl (Gbr. 1c).Sifat koaservat kompleks elektrostatik αS / pLK yang mirip cairan ditunjukkan oleh kemampuannya untuk berfusi dalam milidetik (Gbr. 1d).Dengan menggunakan turbidimetri, kami mengukur pembentukan tetesan dalam kondisi ini, mengkonfirmasi sifat elektrostatik dari interaksi utama yang terkait dengan stabilitasnya (Gambar 1e), dan mengevaluasi pengaruh berbagai rasio polimer pada proses LLPS (Gambar 1f).Meskipun pembentukan tetesan diamati pada berbagai rasio polimer, proses ini sangat menguntungkan bila pLK melebihi αS.LLP juga telah diamati menggunakan zat pengganti dekstran-70 (70 kDa) yang berbeda secara kimia atau menggunakan berbagai format sampel, termasuk tetesan kaca, sumur pelat mikro dari berbagai bahan, Eppendorf atau kapiler kuarsa.
representasi skematis dari berbagai daerah protein dalam varian WT-αS dan ΔCt-αS yang digunakan dalam penelitian ini.Domain N-terminal amfipatik, wilayah pembentuk amiloid hidrofobik (NAC), dan domain terminal-C bermuatan negatif masing-masing ditunjukkan dalam warna biru, oranye, dan merah.Peta Net Charge Per Residual (NCPR) dari WT-αS ditampilkan.b Analisis NMR interaksi αS/pLK tanpa adanya gumpalan makromolekul.Ketika konsentrasi pLK meningkat (rasio molar αS:pLK 1:0,5, 1:1,5, dan 1:10 masing-masing ditunjukkan dalam warna hijau muda, hijau, dan hijau tua).c Coacervate αS/pLK (rasio molar 1:10) pada 25 µM (1 µM berlabel AF488 berlabel αS atau pLK berlabel Atto647N untuk pencitraan WF) dalam buffer LLPS (atas) atau ditambah dengan 500 mM NaCl (kiri bawah) atau setelah 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; kanan bawah).Bilah skala = 20 µm.d Gambar mikroskopis representatif fusi tetesan BF αS/pLK (rasio molar 1:10) pada konsentrasi 25 μM;panah menunjukkan penggabungan masing-masing tetesan (panah merah dan kuning) menjadi tetesan baru (panah oranye) dalam waktu 200 ms) .Bilah skala = 20 µm.e Hamburan cahaya (pada 350 nm) agregasi αS/pLK dalam buffer LLPS sebelum dan sesudah penambahan 500 mM NaCl atau 10% 1,6-HD pada 25 µM αS (N = 3 sampel ulangan, mean dan deviasi standar juga ditunjukkan).f gambar BF (atas) dan analisis hamburan cahaya (pada 350 nm, bawah) agregasi αS/pLK pada 25 μM αS dengan peningkatan rasio molar αS:pLK (N = 3 sampel ulangan, rata-rata dan deviasi standar juga ditunjukkan).Bilah skala = 10 µm.Bilah skala pada satu gambar menunjukkan skala semua gambar dalam satu panel.Data mentah disediakan dalam bentuk file data mentah.
Berdasarkan pengamatan kami terhadap kondensasi kompleks elektrostatis αS/pLK dan pengamatan sebelumnya terhadap αS sebagai molekul klien kondensat tau/RNA melalui interaksi langsung dengan tau31, kami berhipotesis bahwa αS dan tau dapat bersegregasi bersama dengan pelarut tanpa adanya RNA. kondensasi.melalui kompleks elektrostatik, dan αS adalah protein perancah dalam coacervate αS/Tau (lihat distribusi muatan tau pada Gambar 2e).Kami mengamati bahwa ketika 10 μM αS dan 10 μM Tau441 (masing-masing mengandung 1 μM AF488-αS dan 1 μM Atto647N-Tau) dicampur bersama dalam buffer LLPS, mereka dengan mudah membentuk agregat protein yang mengandung kedua protein, seperti yang terlihat oleh mikroskop WF.(Gbr. 2a).Kolokalisasi dua protein dalam tetesan dikonfirmasi dengan mikroskop confocal (CF) (Gambar Tambahan 1a).Perilaku serupa diamati ketika dekstran-70 digunakan sebagai agen agregasi (Gambar Tambahan 1c).Dengan menggunakan PEG atau dekstran berlabel FITC, kami menemukan bahwa kedua agen crowding didistribusikan secara merata ke seluruh sampel, tidak menunjukkan segregasi maupun hubungan (Gambar Tambahan 1d).Sebaliknya, hal ini menunjukkan bahwa dalam sistem ini mereka mendorong pemisahan fase melalui efek crowding makromolekul, karena PEG merupakan agen crowding yang stabil, seperti yang terlihat pada sistem LLP lainnya33,34.Tetesan kaya protein ini sensitif terhadap NaCl (1 M) tetapi tidak terhadap 1,6-HD (10% v/v), yang menegaskan sifat elektrostatiknya (Gambar Tambahan 2a, b).Perilaku cairan mereka dikonfirmasi dengan mengamati peristiwa penggabungan tetesan milidetik menggunakan mikroskop BF (Gbr. 2b).
gambar mikroskop Confocal (CF) dari koacervat αS/Tau441 dalam buffer LLPS (10 μM setiap protein, 0,5 μM αS berlabel AF488, dan Tau441 berlabel Atto647N).b Gambar kontras interferensi diferensial (DIC) yang representatif dari peristiwa fusi tetesan αS/Tau441 (10 μM untuk setiap protein).c Diagram fase berdasarkan hamburan cahaya (pada 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) tanpa adanya (kiri) atau adanya (kanan) 50 µM αS.Warna yang lebih hangat menunjukkan lebih banyak hamburan.d Hamburan cahaya sampel αS/Tau441 LLPS dengan peningkatan konsentrasi αS (Tau441 pada 5 µM, N = 2–3 pengulangan sampel seperti yang ditunjukkan).e Representasi skema beberapa varian protein tau dan wilayah berbeda dari protein yang digunakan dalam penelitian ini: domain N-terminal bermuatan negatif (merah), wilayah kaya prolin (biru), domain pengikat mikrotubulus (MTBD, disorot dalam warna oranye), dan spiral pasangan pembentuk amiloid.daerah filamen (PHF) yang terletak di dalam MTBD (abu-abu).Peta Net Charge Per Residue (NCPR) Tau441 ditampilkan.f Menggunakan 1 µM AF488 berlabel αS dan Atto647N berlabel ΔNt-, menggunakan 1 µM AF488 berlabel αS atau ΔCt-αS dengan adanya ΔNt-Tau (atas, 10 µM per protein) atau K18 (bawah, 50 µM per protein ) ) ) mikrograf WF dikondensasi dalam buffer LLPS atau K18.Bilah skala dalam satu gambar mewakili skala semua gambar dalam satu panel (20 µm untuk panel a, b, dan f).Data mentah untuk panel c dan d disediakan sebagai file data mentah.
Untuk menguji peran αS dalam proses LLPS ini, pertama-tama kami menyelidiki pengaruh αS pada stabilitas tetesan dengan nefelometri menggunakan peningkatan konsentrasi NaCl (Gbr. 2c).Semakin tinggi konsentrasi garam dalam sampel yang mengandung αS, semakin tinggi nilai hamburan cahayanya (pada 350 nm), yang menunjukkan peran stabilisasi αS dalam sistem LLPS ini.Efek serupa dapat diamati dengan meningkatkan konsentrasi αS (dan karenanya rasio αS:Tau441) menjadi kira-kira.Peningkatan 10 kali lipat relatif terhadap konsentrasi tau (5 µM) (Gbr. 2d).Untuk menunjukkan bahwa αS adalah protein perancah dalam coacervates, kami memutuskan untuk menyelidiki perilaku mutan Tau yang terganggu LLPS, yang tidak memiliki daerah terminal-N bermuatan negatif (residu 1–150, lihat Gambar 2e) yang disebut ΔNt-Tau.Mikroskopi dan nefelometri WF mengkonfirmasi bahwa ΔNt-Tau sendiri tidak menjalani LLPS (Gambar 2f dan Gambar Tambahan 2d), seperti yang dilaporkan sebelumnya 14. Namun, ketika αS ditambahkan ke larutan dispersi varian Tau terpotong ini, proses LLPS sepenuhnya selesai. dipulihkan dengan kepadatan tetesan mendekati kepadatan tetesan larutan Tau dan αS ukuran penuh dalam kondisi dan konsentrasi protein yang sama.Proses ini juga dapat diamati dalam kondisi kepadatan makromolekul yang rendah (Gambar Tambahan 2c).Peran wilayah C-terminal αS, tetapi tidak keseluruhan panjangnya, dalam proses LLPS ditunjukkan oleh penghambatan pembentukan tetesan menggunakan varian αS terpotong terminal-C yang tidak memiliki residu 104–140 (Gbr. 1a) dari (ΔCt- αS) protein (Gambar 2f dan Gambar Tambahan 2d).Kolokalisasi αS dan ΔNt-Tau dikonfirmasi dengan mikroskop fluoresensi confocal (Gambar Tambahan 1b).
Untuk menguji lebih lanjut mekanisme LLPS antara Tau441 dan αS, digunakan varian Tau tambahan, yaitu fragmen inti filamen heliks berpasangan (PHF) dalam domain pengikat mikrotubulus (MTBD), yang jika mengandung empat karakteristik domain berulang, biasa juga dikenal sebagai fragmen K18 (lihat Gambar 2e).Baru-baru ini dilaporkan bahwa αS secara istimewa berikatan dengan protein tau yang terletak di domain kaya prolin dalam urutan yang mendahului domain pengikat mikrotubulus.Namun, wilayah PHF juga kaya akan residu bermuatan positif (lihat Gambar 2e), terutama lisin (15% residu), yang mendorong kami untuk menguji apakah wilayah ini juga berkontribusi terhadap kondensasi kompleks αS/Tau.Kami mengamati bahwa K18 saja tidak dapat memicu LLPS pada konsentrasi hingga 100 μM dalam kondisi yang diuji (buffer LLPS dengan 15% PEG atau 20% dekstran) (Gambar 2f).Namun, ketika kami menambahkan 50 µM αS ke 50 µM K18, pembentukan cepat tetesan protein yang mengandung K18 dan αS diamati dengan nefelometri (Gambar Tambahan 2d) dan mikroskop WF (Gambar 2f).Seperti yang diharapkan, ΔCt-αS tidak dapat mengembalikan perilaku LLPS K18 (Gbr. 2f).Kami mencatat bahwa agregasi αS/K18 memerlukan konsentrasi protein yang sedikit lebih tinggi untuk menginduksi LLPS dibandingkan dengan αS/ΔNt-Tau atau αS/Tau441, jika hal-hal lain dianggap sama.Hal ini konsisten dengan interaksi yang lebih kuat dari wilayah terminal αS C dengan domain Tau yang kaya prolin dibandingkan dengan domain pengikat mikrotubulus, seperti yang dijelaskan sebelumnya (31).
Mengingat ΔNt-Tau tidak dapat melakukan LLPS tanpa adanya αS, kami memilih varian Tau ini sebagai model untuk mengkarakterisasi αS/Tau LLPS mengingat kesederhanaannya dalam sistem LLPS dengan Tau panjang penuh (isotipe, Tau441/Tau441).dengan proses agregasi yang kompleks (heterotipe, αS/Tau441).Kami membandingkan tingkat agregasi αS (sebagai bagian dari protein fase terkondensasi, fαS,c) dalam sistem αS/Tau dan αS/ΔNt-Tau dengan sentrifugasi dan analisis SDS-PAGE fase terdispersi (lihat 2e), menemukan nilai yang sangat mirip ​​untuk semua protein pada konsentrasi yang sama.Secara khusus, kami memperoleh fαS,c 84 ± 2% dan 79 ± 7% untuk αS/Tau dan αS/ΔNt-Tau, masing-masing, menunjukkan bahwa interaksi heterotipik antara αS dan tau lebih unggul daripada interaksi antara molekul tau.di antara.
Interaksi dengan berbagai polikation dan pengaruh proses kondensasi pada kinetika αS pertama kali dipelajari dengan metode pemulihan fluoresensi setelah photobleaching (FRAP).Kami menguji coacervates αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau dan αS/pLK (100 μM αS ditambah dengan 2 μM αS AF488-αS dan 100 μM Tau441 atau ΔNt-Tau atau 1 mM pLK).Data diperoleh dalam 30 menit pertama setelah pencampuran komponen sampel.Dari gambar FRAP yang representatif (Gambar 3a, kondensasi αS / Tau441) dan kurva perjalanan waktu yang sesuai (Gambar 3b, Gambar Tambahan 3), dapat dilihat bahwa kinetika αS sangat mirip dengan kinetika Tau441.dan ΔNt-Tau, yang jauh lebih cepat dengan pLK.Koefisien difusi yang dihitung untuk αS di dalam coacervate menurut FRAP (seperti dijelaskan oleh Kang dkk. 35) adalah D = 0,013 ± 0,009 µm2/s dan D = 0,026 ± 0,008 µm2/s untuk αS/Tau441 dan αS/ΔNt- untuk sistem αS/.pLK, Tau, dan D = masing-masing 0,18 ± 0,04 µm2/s (Gbr. 3c).Namun, koefisien difusi αS dalam fase terdispersi beberapa kali lipat lebih tinggi daripada semua fase terkondensasi, sebagaimana ditentukan oleh Spektroskopi Korelasi Fluoresensi (FCS, lihat Gambar Tambahan 3) dalam kondisi yang sama (buffer LLPS) tetapi tanpa adanya polikation. ( D = 8 ± 4 m2/s).Oleh karena itu, kinetika translasi αS berkurang secara signifikan pada koaservat dibandingkan dengan protein dalam fase terdispersi karena efek kepadatan molekul yang nyata, meskipun semua koaservat mempertahankan sifat seperti cairan selama setengah jam pertama setelah pembentukannya, berbeda dengan fase tau.kinetika lebih cepat dalam kondensat pLK.
a – c Analisis FRAP dinamika αS (2% berlabel AF488 αS) dalam coacervate elektrostatik.Gambar representatif pengujian FRAP αS/Tau441 dalam rangkap tiga ditunjukkan pada (a), dengan lingkaran merah menunjukkan area yang mengalami dekolorisasi.Bilah skalanya adalah 5 µm.b Kurva FRAP rata-rata dan (c) menghitung koefisien difusi (D) untuk 5–6 (N) tetesan berbeda dari tiga percobaan menggunakan 100 µM αS dan konsentrasi ekuimolar Tau441 (merah) atau ΔNt-Tau (biru) atau pLK (hijau) sepuluh kali konsentrasi LLPS.Simpangan baku kurva FRAP ditampilkan dalam warna yang diarsir.Sebagai perbandingan, koefisien difusi αS dalam fase terdispersi ditentukan dalam rangkap tiga menggunakan spektroskopi korelasi fluoresensi (FCS) (lihat Gambar Tambahan 3 dan metode untuk informasi lebih lanjut).d Spektra EPR pita-X kontinu 100 μM TEMPOL-122-αS dalam buffer LLPS tanpa polikation apa pun (hitam) atau dengan adanya 100 μM Tau441 (merah) atau ΔNt-Tau (biru) atau 1 mM pLK (hijau).Sisipan menunjukkan tampilan yang diperbesar dari garis medan kuat tempat terjadinya perubahan paling dramatis.e Kurva pengikatan 50 μM TEMPOL-122-αS dengan berbagai polikation tanpa adanya LLPS (tanpa PEG).Berkurangnya amplitudo pita III dibandingkan dengan pita II (IIII/III) dari spektrum EPR yang dinormalisasi terbukti meningkatkan rasio molar Tau441 (merah), ΔNt-Tau (biru) dan pLK (hijau).Garis berwarna menunjukkan kesesuaian dengan data menggunakan model pengikatan kasar dengan n situs pengikatan yang identik dan independen pada setiap kurva.Data mentah disediakan dalam bentuk file data mentah.
Sebagai pelengkap, kami menyelidiki dinamika αS dalam berbagai coacervate menggunakan pelabelan spin terarah (SDSL) dan resonansi paramagnetik elektron kontinu (CW-EPR).Metode ini terbukti sangat berguna dalam melaporkan fleksibilitas dan dinamika IDP dengan resolusi sisa yang realistis36,37,38.Untuk tujuan ini, kami membuat residu sistein dalam mutan Cys tunggal dan menggunakan probe spin 4-hidroksi-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Turunan maleimida memberi label pada mereka.Lebih khusus lagi, kami memasukkan probe TEMPOL pada posisi 122 atau 24 αS (TEMPOL-122-αS dan TEMPOL-24-αS).Dalam kasus pertama, kami menargetkan wilayah terminal-C dari protein, yang terlibat dalam interaksi dengan polikation.Sebaliknya, posisi 24 dapat memberi kita informasi tentang dinamika keseluruhan protein dalam kondensat.Dalam kedua kasus tersebut, sinyal EPR yang diperoleh untuk protein fase terdispersi berhubungan dengan radikal nitroksida dalam keadaan bergerak cepat.Setelah pemisahan fase dengan adanya tau atau pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 atau ΔNt-Tau dengan perbandingan 1:1 atau pLK dengan perbandingan 1:10), peningkatan intensitas puncak relatif diamati pada spektrum EPR dari αS.Garis kehilangan melebar, menunjukkan berkurangnya kinetika reorientasi αS dalam tetesan dibandingkan dengan protein dalam fase encer (Gambar 3d, Gambar Tambahan 4a).Perubahan ini lebih terlihat pada posisi 122. Sedangkan pada posisi 24 keberadaan pLK tidak mempengaruhi kinetika probe, pada posisi 122 bentuk garis spektral berubah secara signifikan (Gambar Tambahan 4a).Ketika kami mencoba memodelkan spektrum pada posisi 122 dari dua sistem αS / polikation menggunakan model isotropik (Gambar Tambahan 5a) yang biasa digunakan untuk menggambarkan dinamika IDP berlabel spin, kami tidak dapat merekonstruksi spektrum eksperimental..Simulasi spektral posisi kontras 24 putaran (Gambar Tambahan 5a).Hal ini menunjukkan bahwa terdapat posisi preferensial dalam ruang konfigurasi putaran wilayah terminal-C αS dengan adanya polikation.Saat mempertimbangkan fraksi αS dalam fase terkondensasi dalam kondisi EPR eksperimental (masing-masing 84 ± 2%, 79 ± 7%, dan 47 ± 4% untuk αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, dan αS/pLK—lihat Tambahan Gambar 2e analisis data c), terlihat bahwa pelebaran yang terdeteksi dengan metode EPR terutama mencerminkan interaksi wilayah terminal C αS dengan berbagai polikation pada fase terkondensasi (perubahan utama saat menggunakan TEMPOL-122- αS), dan bukan kondensasi protein.Peningkatan mikroviskositas diamati pada probe.Seperti yang diharapkan, spektrum EPR protein dalam kondisi selain LLPS dipulihkan sepenuhnya ketika 1 M NaCl ditambahkan ke dalam campuran (Gambar Tambahan 4b).Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa perubahan yang terdeteksi oleh CW-EPR terutama mencerminkan interaksi wilayah terminal C αS dengan berbagai polikation dalam fase kondensasi, dan interaksi ini tampaknya lebih kuat dengan pLK dibandingkan dengan Tau.
Untuk mendapatkan lebih banyak informasi struktural tentang protein dalam coacervate, kami memutuskan untuk mempelajari sistem LLPS menggunakan NMR dalam larutan.Namun, kami hanya dapat mendeteksi fraksi αS yang tersisa dalam fase terdispersi, yang mungkin disebabkan oleh berkurangnya dinamika protein di dalam koaservat dan fase padat di dasar larutan dalam analisis NMR.Ketika kami menganalisis struktur dan dinamika protein yang tersisa dalam fase terdispersi sampel LLPS menggunakan NMR (Gambar Tambahan 5c, d), kami memperhatikan bahwa protein tersebut berperilaku hampir sama di hadapan pLK dan ΔNt-Tau, keduanya dari yang berada dalam struktur sekunder dan dinamika tulang punggung protein, diungkapkan oleh eksperimen pergeseran kimia sekunder dan relaksasi R1ρ.Data NMR menunjukkan bahwa terminal-C αS mengalami kehilangan fleksibilitas konformasi yang signifikan namun tetap mempertahankan sifat tidak teraturnya, seperti rangkaian protein lainnya, karena interaksinya dengan polikation.
Karena perluasan sinyal CW-EPR yang diamati dalam fase kental TEMPOL-122-αS mencerminkan interaksi protein dengan polikation, kami melakukan titrasi EPR untuk mengevaluasi afinitas pengikatan αS ke berbagai polikation tanpa adanya LLPS (tidak ada akumulasi Buffer LLPS), menunjukkan bahwa interaksinya sama dalam fase encer dan pekat (yang dikonfirmasi oleh data kami, Gambar Tambahan 4a dan Gambar Tambahan 6).Tujuannya adalah untuk melihat apakah semua coacervate, meskipun memiliki sifat mirip cairan, menunjukkan perilaku diferensial yang mendasarinya pada tingkat molekuler.Seperti yang diharapkan, spektrum EPR meluas dengan meningkatnya konsentrasi polikation, mencerminkan penurunan fleksibilitas molekuler karena interaksi molekuler dari semua mitra interaksi hampir mencapai saturasi (Gambar 3e, Gambar Tambahan 6).pLK mencapai saturasi ini pada rasio molar yang lebih rendah (polikation:αS) dibandingkan dengan ΔNt-Tau dan Tau441.Faktanya, perbandingan data dengan model pengikatan perkiraan yang mengasumsikan n situs pengikatan identik dan independen menunjukkan bahwa konstanta disosiasi pLK (~5 μM) adalah urutan besarnya lebih rendah daripada Tau441 atau ΔNt-Tau (~50 μM ).μM).Meskipun ini merupakan perkiraan kasar, hal ini menunjukkan bahwa αS memiliki afinitas yang lebih tinggi terhadap polikation sederhana dengan daerah muatan positif kontinu.Mengingat perbedaan afinitas antara αS dan berbagai polikation, kami berhipotesis bahwa sifat cairnya dapat berubah secara berbeda seiring waktu dan karenanya mengalami proses LSPT yang berbeda.
Mengingat lingkungan yang sangat padat di dalam protein coacervate dan sifat amiloid dari protein tersebut, kami mengamati perilaku coacervate dari waktu ke waktu untuk mendeteksi kemungkinan proses LSPT.Dengan menggunakan mikroskop BF dan CF (Gambar 4), kami mengamati bahwa αS/Tau441 sebagian besar berkoaservasi dalam larutan, membentuk tetesan besar yang bersentuhan dan membasahi permukaan di dasar sumur/slide sebagai tetesan penuh, seperti yang diharapkan (Gambar Tambahan .7d);kami menyebut struktur yang terbentuk di dasar ini sebagai “rakit protein”.Struktur ini tetap cair karena mempertahankan kemampuan untuk berfusi (Gambar Tambahan 7b) dan dapat dilihat selama beberapa jam setelah LLPS dipicu (Gambar 4 dan Gambar Tambahan 7c).Kami mengamati bahwa proses pembasahan lebih disukai pada permukaan bahan hidrofilik daripada bahan hidrofobik (Gambar Tambahan 7a), seperti yang diharapkan untuk coacervate elektrostatik dengan muatan tidak seimbang dan dengan demikian potensi permukaan elektrostatik yang tinggi.Khususnya, penggabungan dan arung jeram αS/ΔNt-Tau berkurang secara signifikan, sementara kondensat αS/pLK berkurang secara signifikan (Gbr. 4).Selama waktu inkubasi yang singkat, tetesan αS/pLK mampu menyatu dan membasahi permukaan hidrofilik, namun proses ini dengan cepat berhenti dan setelah 5 jam inkubasi, hanya terjadi penggabungan terbatas dan tidak ada pembasahan yang teramati.– transisi gel-tetes.
Perwakilan BF (panel skala abu-abu) dan CF (panel kanan, berlabel AF488 αS berwarna hijau) dari sampel coacervate yang mengandung 100 µM αS (label fluoresen 1%) dalam buffer LLPS dengan adanya 100 µM Tau441 (atas) fluoresensi) gambar mikroskopis ΔNt -Tau (tengah) atau 1 mM pLK (bawah) pada waktu inkubasi dan ketinggian fokus yang berbeda (z, jarak dari dasar sumur pelat).Percobaan diulangi 4-6 kali secara independen satu sama lain dengan hasil yang sama.Coacervate αS/Tau441 dibasahi setelah 24 jam, membentuk rakit yang lebih besar dari gambar.Bilah skala untuk semua gambar adalah 20 µm.
Kami kemudian bertanya apakah kumpulan protein besar seperti cairan yang terbentuk di αS/Tau441 LLPS akan menyebabkan agregasi amiloid dari salah satu protein yang diteliti.Kami mengikuti pematangan tetesan αS / Tau441 dari waktu ke waktu dengan mikroskop WF dalam kondisi yang sama seperti di atas, tetapi menggunakan 1 μM AF488 berlabel αS dan Tau441 berlabel Atto647N (Gbr. 5a).Seperti yang diharapkan, kami mengamati lokalisasi protein lengkap selama proses pematangan.Menariknya, dari ca.Setelah 5 jam, struktur non-lingkaran yang lebih kuat diamati di dalam rakit, yang kami sebut “titik”, beberapa di antaranya dikolokasikan dengan αS, dan beberapa diperkaya dengan Tau441 (Gbr. 5a, panah putih).Bintik-bintik ini selalu lebih banyak diamati di dalam rakit untuk αS/ΔNt-Tau dibandingkan untuk αS/ΔNt-Tau.Tidak ada titik berbeda pada tetesan sistem pLK dan Tau yang tidak kompeten untuk melakukan fusi/pembasahan.Untuk menguji apakah noda yang mengandung αS dan Tau441 ini merupakan agregat mirip amiloid, kami melakukan percobaan serupa menggunakan mikroskop CF di mana Tau441 diberi label dengan Atto647N dan 12,5 μM thioflavin-T (ThT) spesifik amiloid ditambahkan dari awal.pewarna.Meskipun pewarnaan ThT pada tetesan atau rakit αS/Tau441 tidak teramati bahkan setelah 24 jam inkubasi (Gambar 5b, baris atas—tetesan yang tersisa di atas rakit protein), struktur positif ThT yang mengandung Atto647N-Tau441 di dalam rakit sangat lemah.ini mereplikasi ukuran, bentuk, dan lokasi bintik-bintik yang dijelaskan sebelumnya (Gbr. 5b, baris tengah dan bawah), menunjukkan bahwa bintik-bintik tersebut mungkin berhubungan dengan agregat mirip amiloid yang terbentuk dalam cairan coacervate yang menua.
WF 25 μM αS pada berbagai waktu inkubasi dan ketinggian fokus (z, jarak dari dasar tidak terikat) dengan adanya 25 μM Tau441 (1 μM AF488 berlabel αS dan Atto647N berlabel Tau441) di dalam sumur pelat mikroskop dengan buffer LLPS) .Enam percobaan diulangi secara independen dengan hasil yang serupa.b Gambar mikroskopis CF 25 μM αS dengan adanya 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N berlabel Tau441) dan 12,5 μM thioflavin-T (ThT).Tetesan protein tertimbang serta rakit dan titik protein yang diendapkan masing-masing ditampilkan di baris atas dan tengah.Baris paling bawah menunjukkan gambar rakit dan jatuh dari 3 ulangan independen.Panah putih menunjukkan titik-titik positif ThT di kedua panel.Bilah skala untuk semua gambar adalah 20 µm.
Untuk memeriksa secara lebih rinci perubahan dalam jaringan protein coacervate selama transisi dari cair ke padat, kami menggunakan pencitraan seumur hidup fluoresensi (FLIM) dan mikroskop transfer energi resonansi Förster (FRET) (Gambar 6 dan Gambar Tambahan 8 dan 9).Kami berhipotesis bahwa pematangan lapisan coacervate menjadi struktur protein agregat yang lebih kental atau bahkan padat menyebabkan kontak lebih dekat antara protein dan probe fluoresen yang melekat padanya, berpotensi menghasilkan efek pendinginan yang diwujudkan dalam masa pakai probe yang lebih pendek (τ) , seperti yang dijelaskan sebelumnya40.,41 ,42.Selain itu, untuk sampel berlabel ganda (AF488 dan Atto647N masing-masing sebagai pewarna donor dan akseptor FRET), penurunan τ ini juga dapat disertai dengan kondensasi koaservat dan peningkatan efisiensi FRET(E) selama LSPT.Kami memantau pembentukan rakit dan bintik dari waktu ke waktu dalam sampel LLPS αS/Tau441 dan αS/ΔNt-Tau (25 µM setiap protein dalam buffer LLPS mengandung 1 µM AF488 berlabel αS dan/atau Atto647N berlabel Tau441 atau ΔNt-Tau).Kami mengamati tren umum bahwa masa fluoresensi probe AF488 (τ488) dan Atto647N (τ647N) sedikit menurun seiring dengan matangnya coacervate (Gambar 6 dan Gambar Tambahan 8c).Menariknya, perubahan ini meningkat secara signifikan untuk titik-titik di dalam rakit (Gambar 6c), yang menunjukkan bahwa kondensasi protein lebih lanjut terjadi pada titik-titik tersebut.Untuk mendukung hal ini, tidak ada perubahan signifikan dalam masa fluoresensi yang diamati untuk tetesan αS / ΔNt-Tau yang berumur 24 jam (Gambar Tambahan 8d), menunjukkan bahwa gelasi tetesan adalah proses yang berbeda dari bercak dan tidak disertai dengan reorganisasi molekuler yang signifikan. dalam coacervates.Perlu dicatat bahwa titik-titik tersebut memiliki ukuran dan konten variabel yang berbeda dalam αS, terutama untuk sistem αS/Tau441 (Gambar Tambahan 8e).Penurunan masa fluoresensi titik disertai dengan peningkatan intensitas, terutama untuk Atto647N berlabel Tau441 (Gambar Tambahan 8a), dan efisiensi FRET yang lebih tinggi untuk sistem αS/Tau441 dan αS/ΔNt-Tau, menunjukkan kondensasi lebih lanjut dalam LLPS Lima jam setelah dipicu, protein di dalam listrik statis mengembun.Dibandingkan dengan αS/ΔNt-Tau, kami mengamati nilai τ647N yang lebih rendah dan nilai τ488 yang agak lebih tinggi di titik αS/Tau441, disertai dengan nilai FRET yang lebih rendah dan lebih tidak homogen.Mungkin, hal ini mungkin terkait dengan fakta bahwa dalam sistem αS / Tau441, kelimpahan αS yang diamati dan diharapkan dalam agregat lebih heterogen, seringkali substoikiometri dibandingkan dengan Tau, karena Tau441 sendiri juga dapat menjalani LLPS dan agregasi (Tambahan Gambar. 8e) .Namun, tingkat penggabungan tetesan, pembentukan rakit, dan, yang penting, agregasi protein dalam coacervate yang berbentuk cair adalah maksimal ketika Tau441 dan αS ada.
gambar mikroskop fluoresensi seumur hidup (FLIM) dari αS/Tau441 dan αS/ΔNt-Tau pada 25 μM setiap protein (1 μM AF488 berlabel αS dan 1 μM Atto647N berlabel Tau441 atau ΔNt-Tau) dalam buffer LLPS.Kolom menunjukkan gambar representatif sampel LLPS pada waktu pematangan berbeda (30 menit, 5 jam, dan 24 jam).Bingkai merah menunjukkan wilayah yang mengandung bintik αS/Tau441.Rentang hidup ditampilkan sebagai bilah warna.Bilah skala = 20 µm untuk semua gambar.b Gambar FLIM yang diperbesar dari area yang dipilih, ditunjukkan dalam kotak merah di panel a.Rentang hidup ditampilkan menggunakan skala warna yang sama seperti pada panel a.Bilah skala = 5 µm.c Histogram menunjukkan AF488 (melekat pada αS) atau Atto647N (melekat pada Tau) untuk spesies protein berbeda (tetesan-D-, rakit-R- dan spekel-P) yang diidentifikasi dalam gambar FLIM yang direkam untuk αS-) distribusi waktu seumur hidup Tau441 dan Sampel coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI untuk D, 29-44 ROI untuk R, dan 21-51 ROI untuk poin).Nilai rata-rata dan median masing-masing ditampilkan sebagai kotak kuning dan garis hitam di dalam kotak.Batas bawah dan atas kotak masing-masing mewakili kuartil pertama dan ketiga, dan nilai minimum dan maksimum dalam rentang antarkuartil (IQR) 1,5 kali lipat ditampilkan sebagai kumis.Pencilan ditampilkan sebagai berlian hitam.Signifikansi statistik antara pasangan distribusi ditentukan dengan menggunakan uji-t dua sampel, dengan asumsi varians yang tidak sama.Nilai p uji t dua sisi ditunjukkan dengan tanda bintang untuk setiap pasangan data yang dibandingkan (* nilai p > 0,01, ** nilai p > 0,001, *** nilai p > 0,0001, **** p-value > 0,00001), ns Menunjukkan pengabaian (p-value > 0,05).Nilai p yang tepat diberikan pada Tabel Tambahan 1, dan data asli disajikan sebagai file data mentah.
Untuk lebih menunjukkan sifat bintik/agregat yang mirip amiloid, kami memperlakukan sampel coacervate yang tidak diwarnai selama 24 jam dengan NaCl konsentrasi tinggi (1 M), yang menghasilkan pemisahan agregat dari protein coacervate.Ketika agregat terisolasi (yaitu, larutan agregat terdispersi) diamati menggunakan mikroskop kekuatan atom (AFM), kami mengamati morfologi yang didominasi bola dengan ketinggian teratur sekitar 15 nm, yang cenderung berasosiasi dalam kondisi konsentrasi garam tinggi, mirip dengan perilaku fibril amiloid yang khas karena efek hidrofobik yang kuat pada permukaan (perhatikan bahwa fibril biasanya memiliki ketinggian ~ 10 nm) (Gambar Tambahan 10a).Menariknya, ketika agregat terisolasi diinkubasi dengan ThT dalam uji fluoresensi ThT standar, kami mengamati peningkatan dramatis dalam hasil kuantum fluoresensi ThT, sebanding dengan yang diamati ketika pewarna diinkubasi dengan fibril amiloid αS yang khas (Gambar Tambahan 10b), menunjukkan bahwa agregat coacervate mengandung struktur mirip amiloid..Faktanya, agregat tersebut toleran terhadap konsentrasi garam yang tinggi tetapi sensitif terhadap 4 M guanidin klorida (GdnHCl), seperti fibril amiloid pada umumnya (Gambar Tambahan 10c).
Selanjutnya, kami menganalisis komposisi agregat menggunakan fluoresensi molekul tunggal, spektroskopi korelasi fluoresensi spesifik / korelasi silang (FCS / FCCS), dan analisis ledakan deteksi kebetulan dua warna (TCCD).Untuk tujuan ini, kami mengisolasi agregat yang terbentuk setelah 24 jam inkubasi dalam 100 μl sampel LLPS yang mengandung αS dan Tau441 (keduanya 25 μM) bersama dengan 1 μM AF488 berlabel αS dan 1 μM Atto647N berlabel Tau441.Encerkan larutan agregat terdispersi yang dihasilkan ke keadaan monomolekul menggunakan buffer bebas PEG yang sama dan NaCl 1 M (buffer yang sama yang digunakan untuk memisahkan agregat dari koaservat) untuk mencegah kemungkinan interaksi elektrostatik antara LLPS dan protein.Contoh lintasan waktu suatu molekul dapat dilihat pada Gambar 7a.Analisis FCCS/FCS (korelasi silang, CC dan autokorelasi, AC) menunjukkan bahwa agregat yang mengandung αS dan tau berlimpah dalam sampel (lihat kurva CC pada Gambar 7b, panel kiri), dan kelebihan protein monomer sisa muncul sebagai hasil proses pengenceran (lihat kurva AC pada Gambar 7b, panel kiri).Eksperimen kontrol yang dilakukan pada kondisi larutan yang sama menggunakan sampel yang hanya mengandung protein monomer tidak menunjukkan kurva CC, dan kurva AC cocok dengan model difusi satu komponen (Persamaan 4), di mana protein monomer memiliki koefisien difusi yang diharapkan (Gbr. 7b ), panel kanan).Koefisien difusi partikel agregat kurang dari 1 µm2/s, dan protein monomer sekitar 1 µm2/s.50–100 mikron/detik;nilainya serupa dengan nilai yang dipublikasikan sebelumnya untuk fibril amiloid αS yang disonikasi dan αS monomer secara terpisah dalam kondisi larutan yang serupa44.Ketika kami menganalisis agregat dengan analisis ledakan TCCD (Gbr. 7c, panel atas), kami menemukan bahwa di setiap agregat terisolasi (heteroagregat αS/Tau), sekitar 60% agregat yang terdeteksi mengandung αS dan tau, sekitar 30% hanya mengandung αS dan tau. tau, sekitar 10% αS saja.Analisis stoikiometri heteroagregat αS/Tau menunjukkan bahwa sebagian besar heteroagregat diperkaya dengan tau (stoikiometri di bawah 0,5, jumlah rata-rata molekul tau per agregat adalah 4 kali lebih banyak daripada molekul αS), yang konsisten dengan penelitian kami yang diamati di FLIM in situ eksperimen..Analisis FRET menunjukkan bahwa agregat ini mengandung kedua protein, meskipun nilai FRET sebenarnya dalam hal ini tidak terlalu penting, karena distribusi fluorofor di setiap agregat bersifat acak karena kelebihan protein tidak berlabel yang digunakan dalam percobaan.Menariknya, ketika kami melakukan analisis yang sama menggunakan varian Tau yang kekurangan agregasi amiloid dewasa 45,46 (lihat Gambar Tambahan 11a, b), kami memperhatikan bahwa meskipun agregasi elektrostatik αS adalah sama (Gambar Tambahan 11c, d), kemampuan untuk membentuk agregat dalam coacervate berkurang drastis dan FLIM mendeteksi beberapa titik dalam percobaan in situ, dan kurva korelasi silang yang lemah diamati untuk sampel agregat yang terisolasi.Namun, untuk sejumlah kecil agregat yang terdeteksi (hanya sepersepuluh dari Tau441), kami mengamati bahwa setiap agregat diperkaya dengan αS dibandingkan varian Tau ini, dengan sekitar 50% agregat yang terdeteksi hanya mengandung molekul αS, dan αS bersifat heterogen dalam jumlah berlebih. .agregat (lihat Gambar Tambahan 11e), berbeda dengan agregat heterogen yang dihasilkan oleh Tau441 (Gambar 6f).Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa meskipun αS sendiri mampu terakumulasi dengan tau di dalam koaservat, nukleasi tau lebih menguntungkan dalam kondisi ini, dan agregat mirip amiloid yang dihasilkan mampu bertindak sebagai bentuk αS dan tau.Namun, setelah inti kaya tau terbentuk, interaksi heterotipik antara αS dan tau lebih disukai dalam agregat dibandingkan interaksi homotipik antara molekul tau;kami juga mengamati jaringan protein dalam cairan αS/tau coacervate.
jejak temporal fluoresensi representatif dari molekul tunggal agregat terisolasi yang terbentuk dalam coacervate elektrostatik αS/Tau441.Semburan yang sesuai dengan koagregat αS/Tau441 (semburan di atas ambang batas yang ditunjukkan) diamati dalam tiga saluran deteksi (emisi AF488 dan Atto647N setelah eksitasi langsung, garis biru dan merah, emisi Atto647N setelah eksitasi tidak langsung), FRET, garis ungu).b Analisis FCS/FCCS terhadap sampel agregat αS/Tau441 terisolasi yang diperoleh dari LLPS (panel kiri).Kurva autokorelasi (AC) untuk AF488 dan Atto647N masing-masing ditampilkan dalam warna biru dan merah, dan kurva korelasi silang (CC) yang terkait dengan agregat yang mengandung kedua pewarna ditampilkan dalam warna ungu.Kurva AC mencerminkan keberadaan spesies protein monomer dan agregat berlabel, sedangkan kurva CC hanya menunjukkan difusi agregat berlabel ganda.Analisis yang sama, namun dalam kondisi larutan yang sama seperti pada titik terisolasi, sampel yang hanya mengandung monomer αS dan Tau441 ditampilkan sebagai kontrol di panel kanan.c Analisis kilat fluoresensi molekul tunggal agregat terisolasi yang terbentuk dalam koaservat elektrostatis αS/Tau441.Informasi untuk setiap agregat yang ditemukan dalam empat pengulangan berbeda (N = 152) diplot terhadap stoikiometri, nilai S, dan efisiensi FRET (panel atas, bilah warna mencerminkan kejadian).Tiga jenis agregat dapat dibedakan: agregat -αS saja dengan S~1 dan FRET~0, agregat Tau saja dengan S~0 dan FRET~1, dan agregat Tau/αS heterogen dengan S~antara dan FRET Perkiraan jumlah dari kedua protein penanda yang terdeteksi di setiap agregat heterogen (N = 100) ditampilkan di panel bawah (skala warna mencerminkan kejadiannya).Data mentah disediakan dalam bentuk file data mentah.
Pematangan atau penuaan kondensat protein cair menjadi struktur seperti gel atau padat dari waktu ke waktu telah dilaporkan terlibat dalam beberapa fungsi fisiologis kondensat47 serta penyakit, sebagai proses abnormal yang mendahului agregasi amiloid 7, 48, 49. Di sini kami mempelajari pemisahan fase dan perilaku secara rinci.LSPT αS dengan adanya polikation acak dalam lingkungan terkendali pada konsentrasi mikromolar rendah dan kondisi fisiologis yang relevan (perhatikan bahwa konsentrasi fisiologis αS yang dihitung adalah >1 µM50), mengikuti perilaku khas LPS yang didorong secara termodinamika.Kami menemukan bahwa αS, yang mengandung daerah terminal C bermuatan sangat negatif pada pH fisiologis, mampu membentuk tetesan kaya protein dalam larutan air melalui LLPS dengan adanya peptida dengan gangguan kationik tinggi seperti pLK atau Tau melalui proses elektrostatik. kondensasi kompleks dengan adanya makromolekul agregasi.Proses ini mungkin memiliki efek yang relevan dalam lingkungan seluler di mana αS bertemu dengan berbagai molekul polikationik yang terkait dengan agregasi terkait penyakitnya baik in vitro maupun in vivo51,52,53,54.
Dalam banyak penelitian, dinamika protein dalam tetesan telah dianggap sebagai salah satu faktor kunci yang menentukan proses pematangan55,56.Dalam koaservat αS elektrostatik dengan polikation, proses pematangan tampaknya bergantung pada kekuatan interaksi dengan polikation, valensi, dan banyaknya interaksi ini.Teori ekuilibrium menyatakan bahwa lanskap keseimbangan dua keadaan cair adalah adanya tetesan besar yang kaya akan biopolimer yang menggerakkan LLPS57,58.Pertumbuhan tetesan dapat dicapai dengan pematangan Ostwald59, penggabungan60 atau konsumsi monomer bebas dalam fase terdispersi61.Untuk αS dan Tau441, ΔNt-Tau atau pLK, sebagian besar protein terkonsentrasi dalam kondensat pada kondisi yang digunakan dalam penelitian ini.Namun, meskipun tetesan tau ukuran penuh menyatu dengan cepat pada pembasahan permukaan, penggabungan dan pembasahan tetesan sulit dilakukan untuk ΔNt-Tau dan pLK, menunjukkan hilangnya sifat cair dengan cepat dalam kedua sistem ini.Menurut analisis FLIM-FRET kami, tetesan pLK dan ΔNt-Tau yang sudah tua menunjukkan tingkat agregasi protein yang sama (masa fluoresensi serupa) dengan tetesan asli, menunjukkan bahwa jaringan protein asli dipertahankan, meskipun lebih kaku.
Kami merasionalisasi hasil eksperimen kami dalam model berikut (Gambar 8).Tetesan yang awalnya terbentuk sementara sering kali merupakan jaringan protein tanpa kompensasi elektrostatis, sehingga terdapat area ketidakseimbangan muatan, terutama pada antarmuka tetesan, sehingga menghasilkan tetesan dengan potensi permukaan elektrostatis yang tinggi.Untuk mengkompensasi muatan (sebuah fenomena yang biasa disebut sebagai penipisan valensi) dan meminimalkan potensi permukaan tetesan, tetesan dapat menyertakan polipeptida baru dari fase encer, mengatur ulang jaringan protein untuk mengoptimalkan interaksi muatan-muatan, dan berinteraksi dengan tetesan lain.dengan permukaan (membasahi).Tetesan αS/pLK, karena jaringan proteinnya yang lebih sederhana (hanya interaksi heterotipik antara αS dan pLK) dan afinitas yang lebih besar terhadap interaksi protein-protein, tampaknya mampu menyeimbangkan muatan kondensat dengan lebih cepat;memang, kami mengamati kinetika protein yang lebih cepat pada koaservat αS/pLK yang awalnya terbentuk dibandingkan pada αS/Tau.Setelah penipisan valensi, interaksi menjadi kurang fana dan tetesan kehilangan sifat cairnya dan berubah menjadi tetesan seperti gel yang tidak mudah terbakar dengan potensial permukaan elektrostatik rendah (sehingga tidak dapat membasahi permukaan).Sebaliknya, tetesan αS/Tau kurang efisien dalam mengoptimalkan keseimbangan muatan tetesan karena jaringan protein yang lebih kompleks (dengan interaksi homotipik dan heterotipik) dan sifat interaksi protein yang lebih lemah.Hal ini menghasilkan tetesan yang mempertahankan perilaku cair untuk jangka waktu yang lama dan menunjukkan potensi permukaan elektrostatis yang tinggi yang cenderung diminimalkan dengan penggabungan dan pertumbuhan (sehingga meminimalkan rasio luas permukaan/volume tetesan) dan dengan membasahi bahan kimia permukaan hidrofilik.Hal ini menciptakan perpustakaan protein terkonsentrasi dalam jumlah besar yang mempertahankan sifat fluida karena interaksinya tetap bersifat sementara karena pencarian terus-menerus untuk pengoptimalan muatan dalam jaringan protein.Menariknya, bentuk Tau yang terpotong secara terminal-N, termasuk beberapa isoform yang terjadi secara alami62, menunjukkan perilaku peralihan, dengan beberapa koaservat menua dengan αS menjadi tetesan seperti gel yang berumur panjang, sementara yang lain berubah menjadi kondensat cair besar.Dualitas dalam pematangan coacervate elektrostatik αS ini konsisten dengan studi teoritis dan eksperimental LLPS baru-baru ini yang telah mengidentifikasi korelasi antara penipisan valensi dan pengayakan elektrostatik dalam kondensat sebagai kunci untuk mengendalikan ukuran kondensat dan sifat fluida.Mekanisme 58.61.
Skema ini menunjukkan jalur agregasi amiloid yang diduga untuk αS dan Tau441 melalui LLPS dan LSPT.Dengan tambahan daerah yang kaya anion (merah) dan kaya kation (biru), koaservat elektrostatis αS dan tau dengan valensi yang memuaskan memiliki energi permukaan yang lebih rendah sehingga koalesensinya lebih sedikit, sehingga menghasilkan penuaan tetesan yang cepat.Keadaan gel yang stabil dan tidak diaglomerasi tercapai..Situasi ini sangat menguntungkan dalam kasus sistem αS/pLK karena afinitasnya yang lebih tinggi dan jaringan interaksi pasangan protein yang lebih sederhana, yang memungkinkan terjadinya transisi seperti gel yang cepat.Sebaliknya, tetesan dengan valensi yang tidak memuaskan dan, oleh karena itu, daerah bermuatan protein tersedia untuk interaksi, memudahkan koaservat untuk melebur dan membasahi permukaan hidrofilik untuk mengurangi energi permukaannya yang tinggi.Situasi ini lebih disukai untuk coacervate αS/Tau441, yang memiliki jaringan kompleks multivalen yang terdiri dari interaksi Tau-Tau dan αS-Tau yang lemah.Pada gilirannya, coacervate yang lebih besar akan lebih mudah mempertahankan sifat seperti cairannya, sehingga memungkinkan terjadinya interaksi protein-ke-protein lainnya.Akhirnya, agregat heterogen amiloid yang mengandung αS dan tau terbentuk di dalam cairan koaservat, yang mungkin terkait dengan yang ditemukan di badan inklusi, yang merupakan ciri khas penyakit neurodegeneratif.
Struktur besar seperti cairan yang terbentuk selama pematangan αS/Tau441 dengan lingkungan protein yang sangat padat namun dinamis dan, pada tingkat yang lebih rendah, koaservat αS/ΔNt-Tau merupakan reservoir yang ideal untuk nukleasi agregasi protein.Kami memang telah mengamati pembentukan agregat protein padat pada jenis protein coacervate ini, seringkali mengandung αS dan tau.Kami telah menunjukkan bahwa heteroagregat ini distabilkan oleh interaksi non-elektrostatik, mampu mengikat pewarna ThT spesifik amiloid dengan cara yang sama seperti fibril amiloid pada umumnya, dan memang memiliki ketahanan yang serupa terhadap berbagai pengaruh.Agregat αS/tau yang dibentuk oleh LLPS terbukti memiliki sifat mirip amiloid.Memang, varian dewasa dari kekurangan Tau dalam agregasi amiloid secara signifikan terganggu dalam pembentukan agregat αS heterogen dalam coacervate elektrostatik cair.Pembentukan agregat αS/Tau441 diamati hanya di dalam coacervate, yang mempertahankan sifat seperti cairan, dan tidak pernah terjadi, jika coacervate/tetesan tidak mencapai keadaan gel.Dalam kasus terakhir, peningkatan kekuatan interaksi elektrostatik dan, sebagai akibatnya, kekakuan jaringan protein mencegah penataan ulang konformasi protein yang diperlukan untuk membentuk interaksi protein baru yang diperlukan untuk nukleasi amiloid.Namun, hal ini dapat dicapai dalam coacervate yang lebih fleksibel dan berbentuk cair, yang pada gilirannya cenderung tetap cair seiring bertambahnya ukuran.
Fakta bahwa pembentukan agregat dalam fase terkondensasi lebih disukai pada kondensat αS/Tau yang besar dibandingkan pada tetesan kecil yang cepat membentuk gel, menyoroti relevansi pengidentifikasian faktor-faktor yang mengendalikan penggabungan tetesan.Oleh karena itu, tidak hanya terdapat kecenderungan pemisahan fase, namun ukuran kondensat harus dikontrol agar dapat berfungsi dengan baik serta mencegah penyakit58,61.Hasil kami juga menyoroti pentingnya keseimbangan antara LLPS dan LSPT untuk sistem αS/Tau.Meskipun pembentukan tetesan dapat melindungi terhadap agregasi amiloid dengan mengurangi jumlah monomer protein yang tersedia dalam kondisi jenuh, seperti yang telah diusulkan dalam sistem lain63,64, fusi tetesan pada tingkat tetesan yang tinggi dapat menyebabkan agregasi protein internal melalui penataan ulang konformasi yang lambat.jaringan protein..
Secara keseluruhan, data kami sangat menekankan relevansi valensi kohesif dan interaksi puas/tidak puas dalam jaringan drop dalam konteks LSPT.Secara khusus, kami menunjukkan bahwa kondensat αS/Tau441 full-length mampu berfusi dan nukleasi secara efisien untuk membentuk heteroagregat mirip amiloid yang mencakup kedua protein dan mengusulkan mekanisme molekuler berdasarkan hasil eksperimen kami.Koagregasi dua protein dalam koaservat cairan αS/Tau yang kami laporkan di sini mungkin memang terkait dengan kolokalisasi dua protein dalam inklusi, yang merupakan ciri khas penyakit ini, dan dapat berkontribusi untuk memahami hubungan antara LLPS dan LLPS. agregasi amiloid, membuka jalan bagi IDP bermuatan tinggi dalam degenerasi saraf.
Monomer WT-αS, mutan sistein (Q24C-αS, N122C-αS) dan varian ΔCt-αS (Δ101-140) diekspresikan dalam E. coli dan dimurnikan seperti dijelaskan sebelumnya.5 mM DTT dimasukkan dalam semua langkah pemurnian mutan αS sistein untuk mencegah pembentukan ikatan disulfida.Isoform Tau441 (plasmid diperoleh dari Addgene #16316), varian ΔNt-Tau (Δ1–150, diperoleh dengan mengkloning IVA dengan primer CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) dan varian AggDef-Tau (Δ275–311, dimurnikan dengan primer GGCTC5) Kultur E. coli adalah ditumbuhkan menjadi OD600 = 0,6–0,7 pada 37°C dan 180 rpm, dan ekspresi diinduksi dengan IPTG selama 3 jam pada 37°C.Panen sel pada 11.500 xg selama 15 menit pada suhu 4 °C dan cuci dengan buffer garam yang mengandung 150 mM NaCl.Suspensikan kembali pelet dalam buffer lisis (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin 100 μM).Langkah sonikasi dilakukan di atas es dengan amplitudo 80% selama 10 pulsa (1 menit hidup, 1 menit mati).Jangan melebihi 60 ml dalam satu kali USG.Lisat E. coli dipanaskan pada suhu 95°C selama 20 menit, kemudian didinginkan di atas es dan disentrifugasi pada kecepatan 127.000×g selama 40 menit.Supernatan yang telah diklarifikasi diaplikasikan pada membran 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) dan didialisis dengan 4 L buffer dialisis (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) selama 10 jam.Kolom penukar kation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) diseimbangkan dengan buffer kesetimbangan (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Lisat tau disaring melalui filter PVDF 0,22 μm dan disuntikkan ke dalam kolom dengan laju aliran 1 ml/menit.Elusi dilakukan secara bertahap, tau dielusi dengan buffer elusi 15–30% (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fraksi dianalisis dengan SDS-PAGE, dan setiap fraksi yang mengandung satu pita dengan berat molekul tau yang diharapkan dipekatkan menggunakan filter centrifuge 10 kDa dan diganti dengan buffer yang mengandung 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM dan DTT 2 mM untuk konsentrasi protein akhir adalah 100 μM.Larutan protein kemudian dilewatkan melalui filter PVDF 0,22 μm, dibekukan dengan cepat dan disimpan pada suhu -80°C.Protein K18 dengan baik hati disediakan oleh Prof. Alberto Boffi.Kemurnian sediaan >95% sebagaimana dikonfirmasi oleh SDS-PAGE dan MALDI-TOF/TOF.Berbagai sistein diberi label kimia dengan AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) atau TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).dikonfirmasi oleh serapan dan MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau dan K18 diberi label dengan residu sistein asli pada posisi 191 dan 322 menggunakan Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Jerman) mengikuti prosedur yang sama.Peta muatan bersih per residu untuk αS dan Tau441 dihasilkan menggunakan CIDER66.
Poli-L-lisin padat (pLK DP 90-110 menurut NMR dari pemasok, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) dilarutkan dalam 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH konsentrasi 7,4 hingga 10 mM, proses disonikasi selama 5 menit dalam penangas air ultrasonik dan simpan pada suhu -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) dan FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) larut dalam air dan didistribusikan secara luas dalam buffer LLPS.Dialisis menghilangkan garam yang mengkontaminasi.Mereka kemudian disaring melalui filter jarum suntik dengan ukuran pori 0,22 μm, dan konsentrasinya dihitung menggunakan refraktometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Sampel LLPS disiapkan pada suhu kamar dengan urutan sebagai berikut: buffer dan ekstrusi dicampur dan 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diildinitrile) asam tetraasetat (EDTA, karboksint) dan campuran protease inhibitor 1% (PMSF 100 mM, benzimida 1 mM, leupeptin 5 μM).Kemudian αS dan polikation leburan (pilihan pLK atau Tau) ditambahkan.Untuk percobaan deret waktu tioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), gunakan konsentrasi total ThT menjadi setengah konsentrasi αS.Campur sampel secara perlahan namun menyeluruh untuk memastikan homogenitasnya.Konsentrasi masing-masing komponen bervariasi dari percobaan ke percobaan, seperti dijelaskan di bagian Hasil.Azida digunakan pada konsentrasi 0,02% (b/v) setiap kali durasi percobaan melebihi 4 jam.Untuk semua analisis menggunakan sampel LLPS, biarkan campuran diseimbangkan selama 5 menit sebelum analisis.Untuk analisis hamburan cahaya, 150 μl sampel dimasukkan ke dalam pelat mikro 96 sumur yang tidak mengikat (µClear®, hitam, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) dan ditutup dengan film perekat.LLP dipantau dengan mengukur serapan pada 350 nm di pusat larutan dalam pembaca pelat CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Jerman).Percobaan dilakukan rangkap tiga pada suhu 25°C, dan kesalahan dihitung sebagai deviasi standar dari mean.Fase encer dihitung dengan sentrifugasi sampel dan analisis gel SDS-PAGE, dan fraksi αS dalam fase encer dan pekat dihitung dalam berbagai larutan LLPS.Sampel LLPS 100 μl yang mengandung 1 μM AF488 berlabel αS dibuat dengan pencampuran menyeluruh diikuti dengan sentrifugasi pada 9600 × g selama 30 menit, setelah itu endapan biasanya terlihat.50 μl supernatan teratas digunakan untuk kuantifikasi protein menggunakan gel SDS-PAGE.Gel dipindai dengan filter AF488 menggunakan sistem pencitraan gel ChemiDoc (Laboratorium Bio-Rad, Hercules, CA, USA) atau diwarnai dengan pewarnaan Coomassie dan divisualisasikan dengan filter yang sesuai.Pita yang dihasilkan dianalisis menggunakan ImageJ versi 1.53i (National Institutes of Health, USA).Percobaan dilakukan rangkap dua pada dua percobaan berbeda dengan hasil yang serupa.
Biasanya, 150 μl sampel diaplikasikan pada lempeng mikro 96-sumur yang tidak mengikat dan divisualisasikan pada suhu kamar pada mikroskop terbalik Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman).Untuk percobaan di tempat, pelat Angiogenesis µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman) atau pelat mikro polistiren 96 sumur (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) juga digunakan.Lampu halogen EL6000 atau lampu halida logam merkuri digunakan sebagai sumber penerangan (masing-masing untuk pencitraan BF/DIC dan WF).Untuk mikroskop WF, objektif udara dengan pembesaran 40x (Leica Microsystems, Jerman) digunakan untuk memfokuskan cahaya pada sampel dan mengumpulkannya.Untuk sampel berlabel AF488 dan ThT, filter eksitasi dan emisi dengan set filter GFP standar, filter bandpass eksitasi dan emisi, masing-masing, filter bandpass 460–500 nm dan 512–542 nm, dan cermin dichroic 495 nm.Untuk sampel berlabel Atto647N, satu set standar filter Cy5 dengan filter bandpass eksitasi dan emisi masing-masing 628–40 nm dan 692–40 nm, dan cermin dichroic 660 nm digunakan.Untuk mikroskop BF dan DIC, gunakan tujuan pengumpulan cahaya pantulan yang sama.Cahaya yang dikumpulkan direkam pada kamera CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Jerman).Waktu paparan adalah 50 ms untuk pencitraan mikroskop BF dan DIC dan 20-100 ms untuk pencitraan mikroskop WF.Sebagai perbandingan, waktu pemaparan untuk semua percobaan dengan ThT adalah 100 ms.Eksperimen selang waktu dilakukan untuk memvisualisasikan penggabungan tetesan, dengan gambar dikumpulkan setiap 100 ms selama beberapa menit.ImageJ (NIH, USA) digunakan untuk analisis gambar.Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga dengan hasil yang serupa.
Untuk percobaan kolokalisasi, FRAP dan rekonstruksi 3D, gambar diperoleh pada mikroskop confocal terbalik Zeiss LSM 880 menggunakan edisi biru ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jerman).Sampel sebanyak 50 μl diaplikasikan pada cawan Petri µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Jerman), diolah dengan polimer hidrofilik (ibiTreat) dan dipasang dalam objektif perendaman minyak 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) pada DIC).Gambar diperoleh menggunakan garis laser argon 458 nm, 488 nm, dan 633 nm dengan resolusi 0,26 µm/piksel dan waktu pemaparan 8 µs/piksel untuk jendela deteksi eksitasi dan emisi 470–600 nm, 493–628 nm, dan 638–755 nm masing-masing digunakan untuk memvisualisasikan ThT, AF488 dan Atto647N.Untuk percobaan FRAP, fotografi selang waktu setiap sampel direkam pada 1 frame per detik.Percobaan dilakukan rangkap tiga pada suhu kamar dengan hasil yang serupa.Semua gambar dianalisis menggunakan perangkat lunak Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jerman).Kurva FRAP dinormalisasi, diplot, dan disesuaikan dengan data intensitas/waktu yang diekstraksi dari gambar menggunakan Zen 2 menggunakan OriginPro 9.1.Kurva pemulihan disesuaikan dengan model mono-eksponensial untuk memperhitungkan difusi molekuler dengan suku eksponensial tambahan untuk memperhitungkan efek pemutihan akuisisi.Kami kemudian menghitung D menggunakan radius pemutihan nominal dan waktu paruh pemulihan yang ditentukan sebelumnya seperti dalam persamaan Kang et al.5 35 ditampilkan.
Varian sistein tunggal αS disintesis dengan 4-hidroksi-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) pada posisi 24 (TEMPOL-24-αS) dan 122 (TEMPOL-122-αS), masing-masing.Pelabelan Putar Untuk percobaan EPR, konsentrasi αS ditetapkan pada 100 μM dan konsentrasi PEG adalah 15% (b/v).Untuk berbagai kondisi agregasi, rasio αS:pLK adalah 1:10, sedangkan rasio αS:ΔNt-Tau dan αS:Tau441 dipertahankan pada 1:1.Untuk percobaan titrasi pengikatan tanpa adanya crowding, TEMPOL-122-αS dipertahankan pada 50 μM dan polikation dititrasi pada peningkatan konsentrasi, mempersiapkan setiap kondisi secara terpisah.Pengukuran CW-EPR dilakukan menggunakan spektrometer Bruker ELEXSYS E580 X-band yang dilengkapi dengan resonator Bruker ER4118 SPT-N1 yang beroperasi pada frekuensi gelombang mikro (SHF) ~9,7 GHz.Suhu diatur pada 25°C dan dikontrol oleh cryostat nitrogen cair.Spektrum diperoleh dalam kondisi tak jenuh pada daya MW 4 mW, amplitudo modulasi 0,1 mT, dan frekuensi modulasi 100 kHz.Intensitas spektral dinormalisasi untuk menghindari perbedaan konsentrasi putaran antara sampel dan kemungkinan pengurangan putaran karena konsentrasi sisa zat pereduksi dalam sampel yang mengandung Tau441 atau ΔNt-Tau (ada dalam larutan protein asli).Nilai g yang diberikan diperoleh sebagai hasil pemodelan spektral EPR yang dilakukan menggunakan perangkat lunak Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) yang diimplementasikan di Matlab®67.Model isotropik satu/dua komponen digunakan untuk memodelkan data.Setelah menormalkan semua sinyal, residu dihitung dengan mengurangi setiap simulasi dari spektrum eksperimental yang sesuai.Untuk analisis titrasi pengikatan, intensitas relatif pita ketiga terhadap pita kedua dari spektrum EPR yang dinormalisasi (III/III) digunakan untuk memantau pengikatan polikation ke αS.Untuk memperkirakan konstanta disosiasi (Kd), kurva yang dihasilkan disesuaikan dengan model perkiraan dengan asumsi n situs pengikatan yang identik dan independen.
Percobaan spektroskopi NMR dilakukan dengan menggunakan spektrometer NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) yang dilengkapi dengan cryoprobe dan Z-gradient.Semua percobaan dilakukan dengan menggunakan 130–207 µM αS dan setara αS/ΔNt-Tau dan pLK dalam 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 dan dilakukan pada suhu 15°C.Untuk memantau LPS dengan NMR, 10% PEG ditambahkan ke sampel yang sudah dicampur sebelumnya.Plot gangguan pergeseran kimia (Gbr. 1b) menunjukkan rata-rata pergeseran kimia 1H dan 15N.Spektrum αS 2D1H-15N HSQC ditetapkan berdasarkan penugasan sebelumnya (entri BMRB #25227) dan dikonfirmasi dengan merekam dan menganalisis spektrum 3D HNCA, HNCO, dan CBCAcoNH.Pergeseran kimia 13Cα dan 13Cβ dihitung dengan adanya ΔNt-Tau atau pLK untuk mengukur kemungkinan perubahan tren struktur sekunder dibandingkan dengan pergeseran kimia αS dalam konformasi kumparan acak murni 68 (Gambar Tambahan 5c).Tingkat R1ρ diukur dengan merekam percobaan hsqctretf3gpsi (diperoleh dari perpustakaan Bruker) dengan penundaan 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, dan 800 ms, dan fungsi eksponensial disesuaikan dengan penundaan intensitas puncak pada waktu yang berbeda. kali untuk menentukan R1ρ dan ketidakpastian eksperimentalnya.
Eksperimen mikroskop fluoresensi dua warna yang diselesaikan dengan waktu dilakukan pada mikroskop confocal fluoresensi MT200 komersial yang diselesaikan dengan waktu (PicoQuant, Berlin, Jerman) dengan perangkat penghitungan foton tunggal (TCSPC) yang berkorelasi waktu.Kepala dioda laser digunakan untuk eksitasi interleaved berdenyut (PIE), sinar melewati pandu gelombang mode tunggal dan disetel ke daya laser 10 hingga 100 nW untuk garis laser 481 nm dan 637 nm yang diukur setelah cermin dichroic.Hal ini memastikan tingkat penghitungan foton yang optimal, menghindari efek aliasing foton, photobleaching, dan saturasi.μ-Slide penutup atau pelat angiogenesis angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman) ditempatkan langsung dalam air rendaman di atas lensa Super Apochromat 60x NA 1.2 dengan kerah korektif (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Cermin dichroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) digunakan sebagai pembagi sinar utama.Radiasi yang tidak terfokus dihalangi oleh lubang berdiameter 50 mikron, kemudian radiasi terfokus dibagi menjadi 2 jalur deteksi dengan beam splitter 50/50.Filter emisi bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 untuk pewarna hijau (AF488) dan 690/70 untuk pewarna merah (Atto647N) digunakan di depan detektor.Dioda longsoran foton tunggal (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia) digunakan sebagai detektor.Pengumpulan dan analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SymphoTime64 yang tersedia secara komersial (PicoQuant GmbH, Berlin, Jerman).
Lima puluh mikroliter sampel LLPS diaplikasikan pada sumur angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jerman).Gambar yang dihasilkan difokuskan hingga 20 µm di atas dasar sumur untuk jarak kerja objektif yang optimal untuk tetesan yang tersuspensi dan hingga ~1 µm untuk rakit dan titik dengan resolusi aksial minimal 0,25 µm/piksel dan waktu tunda 400 µs/piksel.Pilih data dengan menerapkan ambang batas intensitas berdasarkan rata-rata intensitas sinyal latar belakang (PBG, mean + 2σ) untuk setiap saluran sehingga hanya tetesan, rakit, atau titik protein cair yang dipilih, menyaring kemungkinan asal usul fase terdispersi.Untuk menganalisis umur masing-masing spesies (τ) dari setiap saluran (hijau, “g” untuk AF488 dan merah, “r” untuk Atto647N), kami memilih wilayah yang diminati (ROI) yang mengandung tetesan, rakit, atau bintik (Gambar Tambahan 1 ).8b) dan memperolehnya dengan menyesuaikan peluruhan seumur hidup (τD, τR dan τP masing-masing untuk tetesan, rakit atau bintik, lihat Gambar Tambahan 8c) di setiap saluran menggunakan analisis tail-fit dan model peluruhan dua komponen.Rata-rata τ dari τ .ROI yang menghasilkan terlalu sedikit foton untuk kesesuaian multi-eksponensial dikeluarkan dari analisis.Batas yang digunakan adalah <104 foton untuk rakit dan titik dan 103 untuk jatuh.Tetesan memiliki ambang batas yang lebih rendah karena sulit untuk mendapatkan kurva peluruhan dengan nilai intensitas yang lebih tinggi, karena tetesan pada bidang gambar biasanya lebih kecil dan jumlahnya lebih sedikit.ROI dengan jumlah foton di atas batas akumulasi foton (disetel ke >500 jumlah/piksel) juga dibuang untuk analisis.Cocokkan kurva peluruhan intensitas yang diperoleh dari wilayah yang diinginkan dengan intensitas sebesar 90% dari maksimum (sedikit setelah intensitas peluruhan maksimum) sejak awal masa pakai untuk memastikan interferensi IRF minimal sambil mempertahankan tingkat yang sama untuk semua peluruhan intensitas pengaturan Jendela waktu relatif Dianalisis 25 hingga 50 ROI untuk rakit dan bintik-bintik dan 15-25 ROI untuk jatuh, gambar dipilih dari lebih dari 4 ulangan yang direkam dari setidaknya 3 percobaan independen.Uji-t dua sisi telah digunakan untuk mengevaluasi perbedaan statistik antar spesies atau antar sistem coacervate.Untuk analisis piksel demi piksel seumur hidup (τ), total redaman seumur hidup di lapangan untuk setiap saluran dihitung dan perkiraan model redaman eksponensial 2/3 komponen dilakukan.Redaman seumur hidup untuk setiap piksel kemudian dipasang menggunakan nilai τ yang dihitung sebelumnya, menghasilkan gambar fit FLIM pseudocolor.Kisaran masa pakai tail-fit adalah sama di semua gambar pada saluran yang sama, dan setiap peluruhan menghasilkan foton yang cukup untuk menghasilkan kecocokan yang andal.Untuk analisis FRET, piksel dipilih dengan menerapkan ambang intensitas yang lebih rendah yaitu 100 foton, yang rata-rata menghasilkan sinyal latar belakang (FBG) sebesar 11 foton.Intensitas fluoresensi setiap saluran dikoreksi dengan faktor koreksi yang ditentukan secara eksperimental: 69 crosstalk spektral α adalah 0,004, eksitasi langsung β adalah 0,0305, efisiensi deteksi γ adalah 0,517.Efisiensi FRET pada level piksel kemudian dihitung menggunakan persamaan berikut:
dimana FDD adalah intensitas fluoresensi yang diamati pada saluran donor (hijau), FDA adalah intensitas fluoresensi yang diamati pada saluran akseptor (merah) dengan eksitasi tidak langsung, dan FAA adalah intensitas fluoresensi yang diamati pada saluran akseptor (merah) dengan eksitasi langsung ( PAI).Pulsa intensitas fluoresensi diamati di saluran).
Tempatkan 100 μl larutan reaksi LLPS yang mengandung 25 µM monomer Tau441 tak berlabel (dengan atau tanpa 25 µM αS) dalam buffer LLPS (ditambahkan seperti di atas) pada pelat mikro 96-sumur yang tidak mengikat dengan lapisan foil perekat dan pembentukan tetesan diperiksa dengan mikroskop WF setelahnya imbang.dalam waktu 10 menit.Setelah 48 jam inkubasi pada suhu kamar, keberadaan rakit dan bercak protein dipastikan.Kemudian dengan hati-hati keluarkan cairan di atas rakit dari sumur, kemudian tambahkan 50 L buffer disosiasi (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) dan inkubasi selama 10 menit.Konsentrasi garam yang tinggi memastikan bahwa LLPS tidak akan terulang karena sisa PEG, dan kemungkinan kumpulan protein yang hanya terbentuk oleh interaksi elektrostatik akan dibongkar.Bagian bawah sumur kemudian dikikis dengan hati-hati menggunakan ujung mikropipet dan larutan yang dihasilkan dipindahkan ke sumur observasi yang kosong.Setelah inkubasi sampel dengan 50 μM ThT selama 1 jam, keberadaan bintik-bintik terisolasi diperiksa dengan mikroskop WF.Siapkan fibril αS yang disonikasi dengan menginkubasi 300 μl larutan 70-µM αS dalam PBS dengan pH 7,4, natrium azida 0,01% pada suhu 37 °C dan 200 rpm pada pengocok orbital selama 7 hari.Solusinya kemudian disentrifugasi pada 9600×g selama 30 menit, pelet diresuspensi dalam PBS pH 7,4 dan disonikasi (1 menit, siklus 50%, amplitudo 80% dalam sonikator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) sampel fibril dengan distribusi ukuran fibril kecil yang relatif seragam.
Analisis FCS / FCCS dan deteksi kebetulan dua warna (TCCD) dilakukan pada mikroskop confocal fluoresen MT200 yang diselesaikan dengan waktu yang sama (Pico-Quant, Berlin, Jerman) yang digunakan untuk eksperimen mikroskop FLIM-FRET menggunakan mode PIE.Kekuatan laser untuk percobaan ini ditambahkan menjadi 6,0 µW (481 nm) dan 6,2 µW (637 nm).Kombinasi kekuatan laser ini dipilih untuk menghasilkan kecerahan serupa untuk pasangan fluorofor yang digunakan sekaligus mencapai laju penghitungan optimal dan menghindari photobleaching dan saturasi.Pengumpulan dan analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SymphoTime64 versi 2.3 yang tersedia secara komersial (PicoQuant, Berlin, Jerman).
Sampel agregat αS/Tau terisolasi yang diperoleh dengan menggunakan LLPS diencerkan dalam buffer isolasi hingga konsentrasi monomolekul yang sesuai (biasanya pengenceran 1:500, karena agregat sudah berada pada konsentrasi rendah ketika diisolasi dari sampel coacervate).Sampel diaplikasikan langsung ke kaca penutup (Corning, USA) yang telah dilapisi dengan larutan BSA pada konsentrasi 1 mg/mL.
Untuk analisis PIE-smFRET di saluran hijau dan merah, ambang intensitas yang lebih rendah yaitu 25 foton diterapkan untuk menyaring sinyal intensitas rendah yang disebabkan oleh peristiwa monomer (perhatikan bahwa jumlah monomer melebihi sampel agregat dibandingkan dengan agregat terisolasi).Ambang batas ini dihitung sebagai lima kali intensitas rata-rata monomer αS yang diperoleh dari analisis sampel monomer murni untuk secara spesifik memilih agregat untuk dianalisis.Sirkuit penggerak PIE, bersama dengan akuisisi data TSCPC, telah memungkinkan penerapan filter pembobotan seumur hidup yang membantu menghilangkan latar belakang dan crosstalk spektral.Intensitas suar yang dipilih menggunakan ambang batas di atas dikoreksi menggunakan sinyal latar rata-rata yang ditentukan dari histogram kejadian versus intensitas/bin sampel hanya buffer.Semburan yang terkait dengan agregat besar biasanya menempati beberapa nampan berturut-turut dalam jejak waktu (diatur ke 1 ms).Dalam kasus ini, bin dengan kekuatan maksimum dipilih.Untuk analisis FRET dan stoikiometri, digunakan faktor gamma yang ditentukan secara teoritis (0,517).Crosstalk spektral dan kontribusi eksitasi langsung dapat diabaikan (ditentukan secara eksperimental) pada daya laser eksitasi yang digunakan.Efisiensi dan stoikiometri FRET dalam suatu ledakan dihitung sebagai berikut.