310 Komponen kimia tabung melingkar baja tahan karat 10*1mm, Domain N-terminal spidroin membentuk hidrogel berdasarkan fibril amiloid dan menyediakan platform untuk imobilisasi protein.

Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Slider menampilkan tiga artikel per slide.Gunakan tombol kembali dan berikutnya untuk menelusuri slide, atau tombol pengontrol slide di akhir untuk menelusuri setiap slide.

Spesifikasi

310 Pemasok tabung melingkar baja tahan karat 10*1mm

Komposisi kimia

Peralatan mekanis

Protein sutra laba-laba rekombinan (protein sutra laba-laba) memiliki banyak aplikasi potensial dalam pengembangan biomaterial baru, namun sifat multimodal dan rawan agregasi membuatnya sulit diperoleh dan mudah digunakan.Di sini kami melaporkan bahwa protein spidroin miniatur rekombinan dan, yang penting, domain N-terminal (NT) itu sendiri dengan cepat membentuk hidrogel mandiri dan transparan pada suhu 37 °C.protein fusi yang terdiri dari NT dan protein fluoresen hijau atau fosforilase nukleosida purin membentuk protein fusi yang berfungsi penuh.Hidrogel.Hasil kami menunjukkan bahwa NT rekombinan dan protein fusi memberikan hasil ekspresi yang tinggi dan memberikan hidrogel sifat yang menarik seperti transparansi, gelasi tanpa ikatan silang, dan imobilisasi langsung protein aktif pada kepadatan tinggi.
Laba-laba memiliki tujuh set kelenjar sutra yang berbeda, masing-masing menghasilkan jenis sutra tertentu.Ketujuh spesies sutera terdiri dari protein sutera laba-laba (spidroin) dengan panjang sekitar 6000 residu dan mengandung wilayah pengulangan pusat yang besar yang dikelilingi oleh domain terminal N dan C berbentuk bola (NT dan CT)1,2.Jenis sutra yang paling banyak dipelajari, ampula primer, diproduksi oleh kelenjar ampula primer.Di kelenjar ini, satu lapisan sel epitel mensintesis protein spidroin dan mengeluarkannya ke dalam lumen kelenjar, di mana mereka hadir dalam bentuk larut (doping) pada konsentrasi yang sangat tinggi (30–50% b/v)3,4.Organisasi dan konformasi protein spidroin ampula utama dalam kelenjar telah diperdebatkan, namun sebagian besar bukti eksperimental menunjukkan adanya konformasi heliks dan/atau heliks acak serta struktur misel atau pipih5,6,7,8,9,10.Sementara domain berulang mengatur sifat mekanik serat sutra, membentuk nanokristal lembaran β dan struktur amorf11,12,13,14,15, domain akhir mengatur serat sutra sebagai respons terhadap perubahan kondisi di sepanjang kelenjar sutra16,17,18.Dengan mengendalikan pembentukan sutra, 19. Domain terminal dilestarikan secara evolusioner dan fungsinya mungkin sama untuk semua protein spidroin 2,20,21.Selama melewati kelenjar, pH spidroin menurun dari sekitar 7,6 menjadi <5,716 dan meningkat dengan geseran dan regangan yang dimediasi oleh pergerakan melalui saluran yang menyempit secara bertahap.Dalam larutan, CT adalah dimer paralel konstitutif α-heliks17, namun sebagai respons terhadap pH rendah dan gaya geser, CT membuka dan mengganti lapisan β16, 17, kemungkinan memicu lapisan β di daerah berulang pada Konversi 16. NT bersifat monomerik di bawah kondisi yang mencerminkan kondisi di lumen kelenjar dan memediasi kelarutan spidroin, tetapi pada pH rendah, protonasi sejumlah rantai samping asam karboksilat menyebabkan dimerisasi NT dengan pKa sekitar 6,5, sehingga menstabilkan NT dan memfiksasi spidroin dalam jumlah besar. jumlah.jaringan16,18.Dengan demikian, NT memainkan peran penting dalam pembentukan filamen, berubah dari monomer pada lapisan menjadi dimer pada serat23,24,25.NT tetap sangat larut dan berbentuk heliks dalam semua kondisi yang dipelajari hingga saat ini16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, yang mengilhami pengembangannya sebagai label peningkat kelarutan untuk produksi protein heterolog.
Protein sutra laba-laba mini rekombinan, terdiri dari satu NT, satu daerah pengulangan pendek, satu CT, dan tag His6 (His-NT2RepCT) untuk pemurnian, larut dalam buffer air seperti protein sutra laba-laba asli dan meniru karakteristik penting asli laba-laba sutra .cakupan 25.31.His-NT2RepCT dapat dipintal menjadi serat kontinu menggunakan mesin biomimetik di mana lapisan larut pH 8 diekstrusi ke dalam penangas air pH 525,32,33,34,35.Fermentasi bioreaktor E. coli yang mengekspresikan His-NT2RepCT dan pasca perlakuan selanjutnya menghasilkan rendemen >14 g/L setelah pemurnian.Hasil yang tinggi, kelarutan yang tinggi, dan respon yang memadai dari His-NT2RepCT terhadap kondisi asam semuanya disebabkan oleh NT23, 25, 34.
Di sini kami melaporkan pembentukan cepat hidrogel transparan dari protein spidroin rekombinan, termasuk NT saja, dengan menginkubasi larutan protein pada suhu 37 °C.Dengan menggunakan fluoresensi tioflavin T (ThT), spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR), spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) dan mikroskop elektron transmisi (TEM), kami menemukan bahwa protein NT dan mikrospider mengalami transformasi struktural menjadi lembaran β dan fibril mirip amiloid saat gel terbentuk.Selain itu, protein fusi NT dan protein fluoresen hijau (GFP) atau purin nukleosida fosforilase (PNP) membentuk hidrogel dengan fragmen fusi yang berfungsi penuh.Ekspresi throughput yang tinggi pada inang heterolog, ditambah dengan pembentukan hidrogel yang cepat dalam kondisi fisiologis, membuka kemungkinan produksi hidrogel dengan fungsi rekayasa yang hemat biaya.
Tidak seperti kebanyakan protein spidroin rekombinan yang dilaporkan36, His-NT2RepCT stabil dalam buffer Tris-HCl pada pH 8 dan dapat dipekatkan hingga 500 mg/mL tanpa pengendapan25.Oleh karena itu, kami terkejut menemukan bahwa protein ini dengan cepat membentuk hidrogel mandiri yang bening secara optik ketika diinkubasi pada suhu 37°C (Gbr. 1b-d).Penelitian lebih lanjut menunjukkan bahwa gelasi His-NT2RepCT terjadi pada berbagai konsentrasi protein (10-300 mg/mL) dan bahwa konsentrasi ini berkorelasi terbalik dengan waktu gelasi (Gambar 1c dan Gambar Tambahan 1).Untuk mengetahui bagian mana dari His-NT2RepCT yang memediasi pembentukan hidrogel, kami kemudian memeriksa setiap domain secara individual dan dalam berbagai kombinasi menggunakan uji inversi labu (Gambar 1a,b).Semua fraksi spidroin rekombinan yang diuji membentuk gel (pada konsentrasi protein 300 mg/mL) dalam waktu kurang dari 1 jam, kecuali untuk 2Rep yang diendapkan (Gbr. 1b).Hal ini menunjukkan bahwa NT dan CT saja, dalam kombinasi, atau dikaitkan dengan pengulangan, dapat membentuk gel pada suhu 37°C dan tag His6 tidak mempengaruhi proses ini secara signifikan.Mengingat gagasan umum bahwa NT adalah protein yang sangat larut dan stabil, dan bahwa laporan sebelumnya tentang hidrogel spidroin rekombinan telah menghubungkan efek gelasi dengan perubahan konformasi di daerah berulang dan/atau CT, NT sendiri dapat melakukannya.Penemuan gelasi tidak terduga.Tabel Tambahan 1) 37, 38, 39. Hebatnya, NT sudah menjadi gel dalam waktu 10 menit pada konsentrasi ≥ 300 mg/mL (Gbr. 1c).Percobaan inversi botol dengan berbagai konsentrasi NT menunjukkan bahwa pada >50 mg/mL larutan NT membentuk gel lebih cepat dibandingkan His-NT2RepCT pada konsentrasi yang sesuai (b/v, Gambar 1c).
Representasi skema berbagai konstruksi spidroin dipelajari dalam karya ini.b Waktu gel pada 37 °C untuk berbagai protein spidroin rekombinan (300 mg/mL) diverifikasi dengan membalik botol.CT gel segera tanpa inkubasi (<300 mg/mL), endapan 2Rep (300 mg/mL, skala 5 mm).c Waktu gel His-NT2RepCT dan NT pada konsentrasi protein yang ditunjukkan pada 37°C.d Foto hidrogel His-NT2RepCT dan NT dengan laba-laba dan huruf “NT” tercetak di bawahnya, masing-masing (keduanya 200 mg/mL, skala bar 5 mm).
Hidrogel yang dibentuk oleh berbagai protein spidroin rekombinan memiliki warna yang sedikit berbeda, dan pengamatan dengan mata telanjang menunjukkan tingkat transparansi yang bervariasi (Gbr. 1b).Gel NT sangat jernih sedangkan gel lainnya menjadi buram.Gel-NT2RepCT dan NT-nya yang dimasukkan ke dalam tabung silinder dapat dikeluarkan dari cetakan secara utuh (Gbr. 1d).
Untuk menguji apakah gel pelapis sutera laba-laba alami dalam kondisi yang sekarang ditemukan menyebabkan gelasi protein spidroin rekombinan, pelapis dikumpulkan dari kelenjar ampulla besar laba-laba jembatan Swedia (Larinioides sclopetarius).Pelapis disimpan dalam 20 mM buffer Tris-HCl pada 50 mg/mL (berdasarkan berat kering yang diukur), tetapi tidak ada gelasi yang diamati selama inkubasi 21 hari pada suhu 37 °C (Gambar Tambahan 2a).
Untuk mengukur gel ini, pengukuran reologi dapat digunakan untuk mempelajari proses gelasi dan menentukan sifat mekanik secara keseluruhan.Secara khusus, pemantauan modulus penyimpanan (elastisitas) pada suhu tinggi dapat memberikan informasi mengenai suhu pembentuk gel serta sifat viskoelastik lapisan.Eksperimen kenaikan suhu (menggunakan 1°C/menit pada 25-45°C, berdasarkan penelitian sebelumnya menggunakan larutan stok sutera alam)40,41 menunjukkan bahwa modulus penyimpanan larutan His-NT2RepCT dan NT meningkat seiring dengan peningkatan suhu.meningkat (Gambar 2 dan Gambar Tambahan 3).Khususnya, modul NT mulai tumbuh pada suhu yang lebih rendah dibandingkan dengan His-NT2RepCT, konsisten dengan waktu gel yang lebih cepat yang diamati ketika NT diinkubasi langsung dengan His-NT2RepCT pada suhu 37°C (Gambar 1).Setelah penurunan suhu berikutnya, modulus penyimpanan tidak kembali ke nilai yang lebih rendah dan tetap di atas modulus kehilangan (lihat Gambar Tambahan 3), menunjukkan gelasi stabil yang tidak dapat diubah secara termal.Setelah gelasi, modulus elastisitas akhir berkisar antara 15 hingga 330 kPa untuk hidrogel His-NT2RepCT pada konsentrasi 100–500 mg/mL, dan modulus elastis akhir untuk hidrogel NT (100–500 mg/mL) berkisar antara 2 hingga 1400 kPa (Gbr. , 2 dan data ramp lengkap) lihat Gambar Tambahan 3).
a Perubahan suhu selama pengukuran His-NT2RepCT (300 mg/mL) dan b NT (300 mg/mL) dengan pengocokan.Panah menunjukkan tren suhu, dan warna yang lebih terang pada data modul penyimpanan menggambarkan pengujian pada nilai torsi yang lebih rendah untuk instrumen daripada yang ditentukan oleh pabrikan, yang merupakan penyebab peningkatan kebisingan.c Akumulasi modul akhir His-NT2RepCT dan NT setelah suhu tinggi (100, 300, dan 500 mg/mL).Semua pembacaan modul diambil pada frekuensi 0,1 Hz.
Sebagai metode potensial untuk menyelidiki perubahan konformasi yang terkait dengan gelasi, kami mencatat spektrum FTIR His-NT2RepCT dan NT sebelum dan sesudah gelasi pada suhu 37°C (Gambar 3a,b).Seperti yang diharapkan, spektrum larutan His-NT2RepCT dan NT berhubungan dengan protein yang menunjukkan struktur sekunder α-helix/kumparan acak, dengan pita yang jelas pada 1645 cm-1.Untuk kedua hidrogel, gelasi menghasilkan pembentukan dua lengan di pita tengah I pada sekitar 1617 cm-1 dan 1695 cm-1 (Gambar 3a, b), yang menunjukkan pembentukan struktur lembaran β antiparalel.Perubahan-perubahan ini juga dapat dilihat dengan jelas pada masing-masing turunan kedua dan spektrum gelasi perbedaan (Gambar Tambahan 4b).Kedua pita pada lapisan NT β lebih menonjol dibandingkan dengan His-NT2RepCT, yang menunjukkan bahwa kandungan total pita lapisan β pada hidrogel NT lebih tinggi dibandingkan dengan hidrogel NT2RepCT.
spektrum serapan FTIR His-NT2RepCT dan b NT (keduanya 500 mg/mL) sebelum (larutan) dan sesudah inkubasi (gel) pada suhu 37°C.c gambar TEM gel NT2RepCT 50 mg/ml yang diresuspensi dan d NT.Bilah skala 200 nm.e Diameter serat hidrogel His-NT2RepCT dan NT.n = 100 fibril terukur, p <0,0001.Bilah kesalahan menunjukkan deviasi standar.Bagian tengah bilah kesalahan adalah mean.Uji-t tidak berpasangan (dua sisi) digunakan untuk analisis statistik.f Fluoresensi ThT berbagai protein spidroin rekombinan (100 mg/mL) pada 37 °C tanpa pengocokan.Percobaan inokulasi g NT (100 mg/mL) dari gel NT 100 mg/mL dengan konsentrasi biji 0%, 5%, 10%, dan 20%.
Analisis gel menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM) menunjukkan bahwa hidrogel terdiri dari fibril mirip amiloid (Gambar 3c, 3d).Fibril yang terbentuk NT memanjang (diameter 5–12 nm) dan tidak bercabang, sedangkan fibril His-NT2RepCT panjangnya lebih pendek dan diameternya jauh lebih lebar (7–16 nm) (Gbr. 3e).Hasil ini memungkinkan kami untuk mengikuti kinetika fibrosis menggunakan uji thioflavin T (ThT).Untuk semua protein spidroin rekombinan, sinyal fluoresen meningkat ketika sampel diinkubasi pada suhu 37 ° C (Gambar 3f, Gambar Tambahan 5a).Konsisten dengan temuan ini, pemeriksaan mikroskopis NT dan His-NT2RepCT dalam kondisi pembentuk gel menunjukkan peningkatan seragam dalam fluoresensi ThT tanpa akumulasi lokal agregat positif ThT (Gambar Tambahan 5b, c).Pembentukan fibril ThT-positif tidak disertai dengan peningkatan kekeruhan NT dan His-NTCT (Gambar Tambahan 5d), yang berarti bahwa jaringan fibril dalam gel dapat terbentuk tanpa mengurangi kejernihan gel.Penyemaian dengan menambahkan sejumlah kecil fibril yang telah terbentuk sebelumnya dapat secara signifikan mempercepat pembentukan fibril beberapa amiloid42,43,44 tetapi menambahkan 5%, 10% atau 20% (b/b) NT ke dalam larutan hidrokoagulan NT.efek penyemaian (Gbr. 3g).Mungkin hal ini disebabkan oleh fakta bahwa fibril dalam hidrogel relatif tetap dan tidak dapat digunakan sebagai benih.
Perilaku tak terduga dari protein spidroin rekombinan pada suhu tinggi mendorong studi spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) lebih lanjut untuk mengidentifikasi perubahan konformasi yang terkait dengan pembentukan gel.Spektrum NMR dari larutan His-NT2RepCT yang direkam dari waktu ke waktu pada suhu 37°C menunjukkan bahwa CT masih terlipat sebagian, sedangkan sinyal NT dan 2Rep telah menghilang (Gambar 4a), menunjukkan bahwa sebagian besar NT dan 2Replah yang mengendalikan sebagian pembentukan His-NT2RepCT. Hidrogel NT2RepCT.Sinyal CT juga dilemahkan hingga 20% dari intensitas aslinya, menunjukkan bahwa CT juga sebagian besar terfiksasi dan dimasukkan ke dalam struktur hidrogel.Untuk sebagian kecil CT, yang bersifat mobile seperti pada sampel yang diinkubasi dan kemudian diamati dengan larutan NMR, spektrumnya kekurangan sinyal untuk 10 residu terstruktur pertama, kemungkinan karena sulitnya imobilisasi bagian yang melekat pada His-NT2Rep.Spektrum NMR dari keadaan hidrogel -NT2RepCT mengungkapkan keberadaan heliks α dan lapisan β yang dominan dan, pada tingkat yang lebih rendah, konformasi kumparan acak (Gbr. 4b).Analisis pergeseran kimia dari residu metionin yang hanya ada di NT menunjukkan bahwa domain ini telah diubah menjadi struktur lembaran-β.Spektrum NT yang bergantung pada waktu dalam larutan menunjukkan penurunan intensitas sinyal yang seragam (Gbr. 4c), dan NMR solid-state hidrogel NT menunjukkan bahwa sebagian besar residu NT dikonversi menjadi struktur lembaran-β (Gbr. 4d).Konformasi 2Rep tidak dapat ditentukan secara terpisah karena kecenderungannya untuk beragregasi.Namun, spektrum NMR keadaan padat dari hidrogel NTCT dan His-NT2RepCT tampak sangat mirip (Gambar 4b; Gambar Tambahan 6b), menunjukkan bahwa 2Rep berkontribusi sedikit pada bagian struktural hidrogel His-NT2RepCT.Untuk hidrogel CT, heliks α, lembaran β, dan struktur sekunder heliks acak ditemukan ada (Gambar Tambahan 6d).Hal ini menunjukkan bahwa beberapa bagian CT tetap menjadi α-heliks sementara yang lain menjadi β-sheet.Dengan demikian, hasil spektroskopi NMR menunjukkan bahwa NT penting untuk pembentukan hidrogel dan juga berubah menjadi konformasi lembaran-β setelah fusi dengan 2Rep dan CT.Konsisten dengan ini, kami baru-baru ini menemukan bahwa ritsleting spasial amiloid kemungkinan terbentuk di kelima heliks domain NT, dan algoritma Waltz memperkirakan wilayah amiloidogenik di heliks 1 (Gbr. 4e).
Spektrum 2D larutan 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT sebelum (biru) dan 19 jam setelah inkubasi (merah) pada suhu 37°C.Puncak persilangan individu pada spektrum merah dan F24, G136, poliA pada spektrum biru dilambangkan dengan simbol asam amino satu huruf dan nomor residu.Sisipan menunjukkan ketergantungan intensitas sinyal terhadap waktu untuk residu terpilih dari domain NT, 2Rep, dan CT.b Spektrum frekuensi radio solid-state (RFDR) dari hidrogel His-NT2RepCT.Korelasi residu Cα/Cβ yang diamati dalam spektrum RFDR ditentukan melalui perbandingan dengan model pergeseran kimia peptida dan nilai yang diperoleh dari statistik82,83 dan struktur sekundernya.SSB – pita samping berputar.c Spektrum satu dimensi larutan 15N-HSQC 10 mg/mL NT selama inkubasi pada suhu 37 °C selama 36 jam.Sisipan menunjukkan intensitas volumetrik versus waktu.d Spektrum RFDR keadaan padat hidrogel NT.Korelasi residu Cα/Cβ dan struktur sekundernya yang diamati dalam spektrum RFDR ditunjukkan.e Berdasarkan profil kecenderungan fibrilasi NT45.79 dari database Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Energi Rosetta dari jendela pergeseran petir spasial heksapeptida ditunjukkan dalam kkal/mol.Batang merah menunjukkan heksapeptida dengan kecenderungan fibrosis tinggi (energi Rosetta di bawah -23 kkal/mol; di bawah garis putus-putus).Bilah hijau menunjukkan fragmen dengan energi Rosetta di atas ambang batas sehingga kecil kemungkinannya untuk membentuk ritsleting sterik.Fragmen yang mengandung prolin dikeluarkan dari analisis (tanpa kolom).Kotak menunjukkan area amiloidosis yang diprediksi oleh algoritma Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Urutan residu asam amino NT ada di atas, dan jenis residu yang ditemukan dalam struktur sekunder β (ditentukan dengan spektroskopi NMR solid-state) ditunjukkan dengan warna merah.Posisi lima heliks NT α ditetapkan sebagai (H1-H5)28.
Pada pH <6,5, HT mengalami dimerisasi, sehingga tahan terhadap denaturasi yang disebabkan oleh panas atau urea18.Untuk menjelaskan bagaimana dimerisasi dan stabilitas NT mempengaruhi gelasi, larutan yang mengandung 100 mg/ml NT dikontrol pada pH 8, 7, dan 6 menggunakan uji inversi vial.Sampel NT diinkubasi pada pH 8 dan 7 menjadi gel setelah 30 menit pada suhu 37 °C, tetapi gel pH 8 tetap jernih, sedangkan gel pH 7 menunjukkan endapan yang terlihat (Gbr. 5a).Sebaliknya, larutan yang mengandung HT pada pH 6 tidak membentuk gel, dan endapan yang besar dapat terlihat setelah 20 menit pada suhu 37°C.Hal ini menunjukkan bahwa dimer itu sendiri dan/atau stabilitasnya yang lebih tinggi dibandingkan monomer mencegah gelasi.Diperkirakan tidak akan terbentuk endapan NT pada pH 7 dan 6, karena dilaporkan bahwa NT larut pada 200 mg/ml27, mudah terlipat kembali setelah denaturasi panas, dan juga mempertahankan α-heliks pada nilai yang lebih rendah. pH 18. Penjelasan yang mungkin untuk perbedaan ini adalah bahwa percobaan yang dilaporkan sebelumnya dilakukan pada suhu kamar atau di bawahnya, atau pada konsentrasi protein yang relatif rendah16,18,19.
Uji inversi vial NT (100 mg/mL) pada pH 8, 7, 6 dan 154 mM NaCl (pH 8) setelah inkubasi pada suhu 37°C.b Spektrum NT CD dengan dan tanpa masing-masing 154 mM NaF dan 154 mM NaCl.Eliptisitas molar pada 222 nm diubah menjadi proporsi lipatan alami.c Uji inversi NT (100 mg/mL) NT* (37 °C dan 60 °C), NTA72R (37 °C), dan His-NT-L6 (37 °C dan 60 °C).d Spektrum CD mutan NT NT*, NTA72R, dan His-NT-L6.Eliptisitas molar pada 222 nm diubah menjadi proporsi lipatan alami.e Uji inversi NTFlSp, NTMiSp dan NTMiSp tereduksi (100 mg/mL).Bilah skala 5 mm.f spektrum CD NT, NTFlSp, NTMiSp dan NTMiSp tereduksi.Eliptisitas molar pada 222 nm diubah menjadi proporsi lipatan alami.Spektrum NT penuh pada 25 °C dan 95 °C ditunjukkan pada Gambar Tambahan 8.
Konsentrasi garam fisiologis menentukan interaksi elektrostatik antara subunit NT dan dimerisasi transfer NT ke pH18 yang lebih rendah.Kami menemukan bahwa kehadiran 154 mM NaCl dan NaF masing-masing memang menghambat gelasi (Gambar 5a, b; Gambar Tambahan 2b) dan bahwa garam ini meningkatkan stabilitas termal monomer NT (Gambar 5b, Gambar Tambahan. 8) .Hal ini juga menunjukkan bahwa peningkatan stabilitas, bukan dimerisasi, mencegah pembentukan gel.
Untuk mengeksplorasi lebih jauh peran dimerisasi dan stabilitas protein dalam gelasi, kami menggunakan dua mutan, NT* dan NTA72R, yang juga tetap monomer pada pH rendah28,30.NT* adalah mutan pembalikan muatan ganda di mana distribusi muatan dipolar monomer diratakan, yang mencegah dimerisasi dan secara drastis meningkatkan stabilitas monomer.NTA72R adalah dipol bermuatan, tetapi Ala yang tersubstitusi Arg terletak di batas dimer, sehingga mutasi mengganggu interaksi subunit yang diperlukan untuk dimerisasi.Setelah inkubasi pada suhu 37°C, NT* tidak membentuk hidrogel, sedangkan NTA72R membentuk gel buram selama 15 menit (Gbr. 5c).Karena NT* dan NTA72R tidak dapat melakukan dimerisasi tetapi berbeda dalam stabilitas monomer (Gbr. 5d), hasil ini sangat menunjukkan bahwa stabilitas termodinamika yang tinggi mencegah pembentukan gel NT.Hal ini juga didukung oleh fakta bahwa HT* membentuk gel ketika tidak stabil pada suhu tinggi (setelah 8 menit pada suhu 60°C; Gambar 5c).Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa kandungan metionin yang tinggi dalam NT mencairkan lipatan alaminya dan enam pengganti Met ke Leu (disebut di sini sebagai His-NT-L6) sangat menstabilkan monomer NT46.Berdasarkan asumsi bahwa fleksibilitas struktural diperlukan untuk pembentukan gel NT, kami menemukan bahwa mutan stabil His-NT-L6 tidak membentuk gel pada suhu 37 ° C (Gambar 5c, d).Namun, His-NT-L6 juga membentuk gel setelah inkubasi pada suhu 60°C selama 60 menit (Gbr. 5c).
Kemampuan NT untuk bertransformasi menjadi struktur lembaran β dan membentuk hidrogel tampaknya berlaku untuk beberapa tetapi tidak semua domain spidroin NT.NT dari berbagai jenis sutra dan spesies laba-laba, Trichonephila clavipes (NTFlSp), membentuk gel meskipun kandungan metioninnya relatif rendah dan stabilitas termal yang tinggi (Gambar 5e, f dan Tabel Tambahan 2).Sebaliknya, NT dari spidroin protein ampula kecil dari Araneus ventricosus (NTMiSp) dengan stabilitas termal rendah dan kandungan metionin tinggi tidak membentuk hidrogel (Tabel Tambahan 2 dan Gambar 5e, f).Yang terakhir ini mungkin terkait dengan adanya ikatan disulfida intramolekul29,47.Secara konsisten, ketika ikatan disulfida NTMiSp berkurang, ia membentuk hidrogel setelah inkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit (Gbr. 5e).Sebagai kesimpulan, perlu dicatat bahwa fleksibilitas struktural merupakan kriteria penting, namun bukan satu-satunya, untuk pembentukan gel dari NT.Faktor lain yang mungkin relevan adalah kecenderungan untuk membentuk fibril amiloid, dan analisis dengan database ritsleting dan algoritma Waltz menunjukkan korelasi antara kemampuan untuk membentuk gel dan keberadaan daerah amiloidogenik, serta luasnya daerah yang diprediksi. untuk membentuk ritsleting sterik.Ada korelasi (Tabel Tambahan 2 dan Gambar Tambahan 9).
Kemampuan NT untuk membentuk fibril dan membentuk gel dalam kondisi yang menguntungkan membuat kami berhipotesis bahwa fusi NT dengan fragmen protein lain masih dapat membentuk gel dengan fungsi penuh sebagai mitra fusi.Untuk mengujinya, kami memperkenalkan protein fluoresen hijau (GFP) dan purin nukleosida fosforilase (PNP) masing-masing di terminal-C NT.Protein fusi yang dihasilkan diekspresikan dalam E. coli dengan hasil akhir yang sangat tinggi (masing-masing kultur labu kocok 150 mg/L dan 256 mg/L untuk His-NT-GFP dan His-NT-PNP), konsisten dengan apa yang telah ditunjukkan. untuk Protein lain yang menyatu dengan NT Ref.30. Protein fusi His-NT-GFP (300mg/mL) dan His-NT-PNP (100mg/mL) membentuk gel setelah 2 jam dan 6,5 jam pada suhu 37°C dan, yang terpenting, fraksi GFP tetap tidak berubah.diamati setelah gelasi, dengan >70% intensitas fluoresensi awal tersisa setelah gelasi (Gambar 6a).Untuk mengukur aktivitas PNP dalam larutan dan gel-NT-PNP miliknya, kami harus mengencerkan protein fusi dengan NT karena aktivitas enzimatik dari sediaan murni berada di luar jangkauan deteksi pengujian pada konsentrasi pembentuk gel.Gel yang dibentuk dengan campuran yang mengandung 0,01 mg/mL His-NT-PNP dan 100 mg/mL NT mempertahankan 65% aktivitas enzimatik awal dari sampel yang dipreinkubasi (Gbr. 6b).Gel tetap utuh selama pengukuran (Gambar Tambahan 10).
intensitas fluoresensi relatif sebelum dan sesudah gelasi His-NT-GFP (300 mg/mL) dan botol terbalik yang berisi hidrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) di bawah sinar tampak dan sinar UV.Poin menunjukkan pengukuran individu (n = 3), bilah kesalahan menunjukkan deviasi standar.Nilai rata-rata ditampilkan di tengah bilah kesalahan.b Aktivitas PNP diperoleh dengan analisis fluorometri menggunakan larutan dan gel yang terdiri dari NT (100 mg/ml) dan campuran yang mengandung 0,01 mg/ml his-NT-PNP dan 100 mg/ml dolar Taiwan Baru.Sisipan menunjukkan botol terbalik berisi hidrogel yang mengandung His-NT-PNP (batang skala 5 mm).
Di sini, kami melaporkan pembentukan hidrogel dari NT dan protein spidroin rekombinan lainnya dengan menginkubasi larutan protein pada suhu 37°C (Gambar 1).Kami menunjukkan bahwa gelasi dikaitkan dengan transformasi heliks α menjadi lapisan β dan pembentukan fibril mirip amiloid (Gambar 3 dan 4).Temuan ini mengejutkan karena NT merupakan kumpulan lima heliks berbentuk bulat yang dikenal karena kelarutannya yang sangat tinggi dan stabilitasnya yang tinggi pada konsentrasi >200 mg/mL pada suhu 4°C selama beberapa hari27.Selain itu, NT mudah terbentuk kembali setelah denaturasi panas pada konsentrasi protein rendah dalam µM.Menurut hasil kami, pembentukan fibril memerlukan kombinasi konsentrasi protein >10 mg/mL dan suhu yang sedikit lebih tinggi (Gbr. 1).Hal ini konsisten dengan gagasan bahwa fibril amiloid dapat terbentuk dari protein terlipat globular yang berada dalam keadaan terbuka sebagian karena fluktuasi termal dalam kondisi fisiologis48.Contoh protein yang mengalami konversi ini termasuk insulin49,50, β2-mikroglobulin, transthyretin dan lisozim51,52,53.Meskipun NT adalah α-heliks dalam keadaan aslinya, sekitar 65% rantai polipeptida kompatibel dengan pembentukan ritsleting sterik (Gbr. 4e) 45 .Karena monomernya bergerak secara dinamis46, ia dapat mengekspos daerah amiloidogenik potensial ini pada suhu yang cukup tinggi dan pada konsentrasi protein total yang tinggi dapat mencapai konsentrasi kritis untuk pembentukan fibril amiloid54.Mengikuti alasan ini, kami menemukan korelasi negatif antara konsentrasi spidroin dan waktu gelasi (Gbr. 1c), dan jika konformasi NT monomer distabilkan baik dengan mutasi (NT*, His-NT-L6) atau dengan penambahan garam, dapat mencegah pembentukan hidrogel (Gbr. 5).
Dalam kebanyakan kasus, fibril amiloid menghilang dari larutan sebagai endapan, namun dalam kondisi tertentu mereka dapat membentuk hidrogel55,56,57.Fibril pembentuk hidrogel biasanya memiliki rasio aspek tinggi dan membentuk jaringan tiga dimensi yang stabil melalui keterikatan molekul,55,58 konsisten dengan hasil kami.Untuk pembentukan hidrogel in vitro, protein seringkali terbuka seluruhnya atau sebagian, misalnya dengan paparan pelarut organik, suhu tinggi (70–90°C) dan/atau pH rendah (1,5–3,0)59,60,61,62.Hidrogel spidroin yang dijelaskan di sini tidak memerlukan pemrosesan yang keras, juga tidak memerlukan bahan pengikat silang untuk menstabilkan hidrogel.
Sebelumnya telah dilaporkan bahwa pengulangan spidroin dan QD, yang tampaknya mengalami peralihan β-sheet selama pemintalan sutra, membentuk hidrogel.Dibandingkan dengan temuan kami, waktu inkubasi dan/atau suhu inkubasi secara signifikan lebih lama atau lebih tinggi, dan hidrogel yang dihasilkan seringkali buram (Gambar 7 dan Tabel Tambahan 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Selain waktu gel yang cepat, hidrogel NT >300 mg/mL (30%) mengungguli semua hidrogel protein sutera laba-laba rekombinan lainnya, serta hidrogel alami seperti gelatin, alginat (2%), agar (0,5 % ) dan kolagen.(0,6%) (Gambar 7 dan Tabel Tambahan 1 dan 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Waktu gel dan modulus elastisitas hidrogel dalam penelitian ini dibandingkan dengan hidrogel berbasis spidroin lainnya dan hidrogel alami terpilih.Referensi diberikan bersama dengan deskripsi kondisi gelasi.APS Amonium persulfat, suhu kamar.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Laba-laba tampaknya telah mengembangkan cara untuk mencegah spidroin membentuk gel selama penyimpanan.Meskipun terdapat konsentrasi protein yang tinggi pada kelenjar sutra, wilayah pengulangan yang besar terkait dengan domain terminal berarti bahwa konsentrasi NT dan CT yang tampak pada kelenjar tersebut setara dengan sekitar 10-20 mg/ml, pada batas penelitian ini.diperlukan untuk pembentukan hidrogel yang diamati secara in vitro.Selain itu, konsentrasi garam yang serupa 16 menstabilkan NT, seperti pada kelenjar sutra (Gbr. 5b).Konformasi NT telah dipelajari dalam sitosol E. coli dan ditemukan lipatannya lebih rapat dibandingkan saat diperiksa secara in vitro, yang selanjutnya menunjukkan bahwa garam atau faktor lain mencegah agregasinya secara in vivo.Namun, kemampuan NT untuk bertransformasi menjadi fibril β-sheet mungkin penting untuk pembentukan filamen dan harus diselidiki dalam penelitian selanjutnya.
Selain aspek baru dari pembentukan fibril dan hidrogel mirip NT-amiloid yang diamati dalam penelitian ini, kami juga menunjukkan bahwa fenomena ini mungkin memiliki aplikasi bioteknologi dan biomedis (Gbr. 8).Sebagai bukti konsep, kami menggabungkan NT dengan GFP atau PNP dan menunjukkan bahwa protein fusi juga membentuk hidrogel ketika diinkubasi pada suhu 37 °C dan sebagian besar fraksi GFP dan PNP mempertahankan aktivitasnya setelah gelasi (Gambar 6).Fosforilase nukleosida adalah katalis penting sintesis analog nukleosida75, yang menjadikan penemuan kami relevan untuk industri biofarmasi.Konsep ekspresi protein fusi yang membentuk hidrogel transparan dalam kondisi yang menguntungkan memungkinkan terciptanya hidrogel yang difungsikan dengan sifat yang menguntungkan untuk berbagai aplikasi seperti imobilisasi enzim, pelepasan obat terkontrol, dan rekayasa jaringan.Selain itu, NT dan NT* adalah penanda ekspresi yang efisien30, yang berarti bahwa NT dan variannya dapat digunakan untuk produksi protein fusi terlarut dengan throughput tinggi dan selanjutnya pembuatan protein target yang diimobilisasi dalam hidrogel 3D.
NT larut, α-heliks dan stabil pada konsentrasi rendah (µM) dan 37°C.Pada suhu yang sama, tetapi pada konsentrasi yang meningkat (>10 mg/ml), NT membentuk gel yang terdiri dari fibril mirip amiloid.Protein fusi NT juga membentuk gel fibrilar dengan fragmen fusi yang berfungsi penuh, memungkinkan berbagai protein diimobilisasi dalam hidrogel 3D menggunakan NT.Bawah: NT (PDB: 4FBS) dan ilustrasi jaringan serat dan struktur protein terkait (diasumsikan dan tidak digambarkan berdasarkan skala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstruksinya (lihat Tabel Tambahan 4 untuk daftar lengkap termasuk urutan asam amino) dikloning menjadi plasmid pT7 dan diubah menjadi E. coli BL21 (DE3).E. coli yang mengandung plasmid hasil rekayasa diinokulasi dalam kaldu Luria yang dilengkapi dengan kanamisin (70 mg/l) dan ditumbuhkan semalaman pada suhu 30°C dan 250 rpm.Kultur kemudian diinokulasi 1/100 ke dalam media LB yang mengandung kanamisin dan dikultur pada suhu 30°C dan 110 rpm hingga OD600 mencapai 0,8.Untuk studi NMR, bakteri ditumbuhkan dalam media minimal M9 yang mengandung 2 g D-glukosa 13C (Aldrich) dan 1 g amonium klorida 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) untuk pelabelan protein dengan isotop.Turunkan suhu hingga 20 derajat Celsius dan induksi ekspresi protein dengan 0,15 mM isopropylthiogalactopyranoside (konsentrasi akhir).Setelah ekspresi protein semalaman, sel dipanen pada 7278×g, 4°C selama 20 menit.Pelet sel diresuspensi dalam 20 mM Tris-HCl, pH 8, dan dibekukan hingga digunakan lebih lanjut.Sel yang dicairkan dilisiskan menggunakan pengganggu sel (mesin seri TS, Constant Systems Limited, Inggris) pada 30 kPa.Kemudian lisat disentrifugasi pada 25.000 g selama 30 menit pada suhu 4°C.Untuk NTMiSp, pelet kemudian diresuspensi dalam 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, dan disonikasi selama 2 menit (2 detik hidup/mati, 65%), kemudian disentrifugasi lagi pada 25.000 xg, 4°C. 30 menit.Supernatan dimasukkan ke dalam kolom Ni-NTA, dicuci dengan 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8, dan terakhir protein dielusi dengan 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8. Untuk menghasilkan NT2RepCT dan NTCT, pencernaan trombin memperkenalkan situs (ThrCleav) antara His dan NT.Situs pembelahan trombin juga terdapat pada His-NT-ThrCleav-2Rep (menghasilkan 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (menghasilkan NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (menghasilkan CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (menghasilkan NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (menghasilkan NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (menghasilkan NTF1Sp), dan His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (menghasilkan NTMiSp).Konstruksinya dicerna dengan trombin (1:1000) dan didialisis semalaman pada suhu 4°C dengan 20 mM Tris-HCl, pH 8, menggunakan membran dialisis Spectra/Por dengan ambang batas berat molekul 6-8 kDa.Setelah dialisis, larutan dimasukkan ke dalam kolom Ni-NTA dan limbah yang mengandung protein yang diinginkan dikumpulkan.Konsentrasi protein ditentukan dengan mengukur serapan UV pada 280 nm menggunakan koefisien pemadaman masing-masing protein, kecuali NTF1Sp, yang menggunakan uji Bradford sesuai dengan protokol pabrikan.Kemurnian ditentukan dengan elektroforesis gel SDS poliakrilamida (4-20%) dan pewarnaan biru cemerlang Coomassie.Protein dipekatkan menggunakan filter centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) pada 4000 xg dengan batas berat molekul 10 kDa dalam siklus 20 menit.
Cairkan larutan protein dan pipet dengan hati-hati 150 μl ke dalam botol septum bening 1 ml (Termo Scientific 8 x 40 mm).Tabung ditutup dan ditutup dengan parafilm untuk mencegah penguapan.Sampel (n = 3) diinkubasi pada suhu 37°C atau 60°C dan dibalik secara berkala untuk mengamati gelasi.Sampel yang tidak berbentuk gel diinkubasi setidaknya selama satu minggu.Kurangi ikatan disulfida NTMiSp dengan 10 mM DTT per 10 µM protein.Untuk menganalisis gelasi lapisan sutera laba-laba alami, laba-laba jembatan Swedia dipotong, dua kelenjar ampul utama ditempatkan dalam 200 μl 20 mM buffer Tris-HCl pH 8 dan dipotong untuk memungkinkan lapisan terpisah dari kelenjar..Isi kelenjar dilarutkan dalam buffer, 50 μl untuk penentuan berat kering (dengan inkubasi vial terbuka pada suhu 60 °C hingga berat konstan) dan 150 μl untuk gelasi pada suhu 37 °C.
Geometri/alat ukurnya terbuat dari bahan stainless steel dengan menggunakan pelat sejajar dengan diameter atas 20 mm dan celah 0,5 mm.Panaskan sampel dari 25 °C menjadi 45 °C dan kembali ke 25 °C dengan laju 1 °C per menit menggunakan pelat Peltier berbahan baja tahan karat.Pengukuran getaran dilakukan pada frekuensi 0,1 Hz dan di daerah viskoelastik linier material pada regangan 5% dan 0,5% untuk sampel masing-masing 100 mg/mL dan 300–500 mg/mL.Gunakan ruang kelembapan khusus untuk mencegah penguapan.Data dianalisis menggunakan Prism 9.
Untuk mengumpulkan spektrum inframerah (IR) pada suhu kamar dari 800 hingga 3900 cm–1.Perangkat ATR, serta jalur cahaya melalui spektrometer, dibersihkan dengan udara kering yang disaring sebelum dan selama percobaan.Larutan (500 mg/mL untuk meminimalkan puncak penyerapan air dalam spektrum) dipipet ke kristal, dan gel (500 mg/mL) dibentuk sebelum pengukuran dan kemudian dipindahkan ke kristal (n = 3).1000 pemindaian direkam dengan resolusi 2 cm-1 dan siklus kerja nol 2. Turunan kedua dihitung menggunakan OPUS (Bruker) menggunakan rentang pemulusan sembilan poin.Spektrum dinormalisasi ke wilayah integrasi yang sama antara 1720 dan 1580 cm-1 menggunakan F. Menges “Spectragryph – Perangkat Lunak Spektroskopi Optik”.Dalam spektroskopi ATR-IR, kedalaman penetrasi sinar inframerah ke dalam sampel bergantung pada bilangan gelombang, sehingga menghasilkan penyerapan yang lebih kuat pada bilangan gelombang yang lebih rendah dibandingkan pada bilangan gelombang yang lebih tinggi.Efek ini belum dikoreksi untuk spektrum yang ditunjukkan pada Gambar.3 karena ukurannya sangat kecil (Gambar Tambahan 4).Spektrum yang dikoreksi untuk angka ini dihitung menggunakan perangkat lunak Bruker OPUS.
Pada prinsipnya, kuantifikasi konformasi protein secara komprehensif dapat dilakukan setelah dekonvolusi komponen dalam puncak Amida I yang dapat diandalkan.Namun, ada beberapa kendala yang muncul dalam praktiknya.Kebisingan dalam spektrum dapat muncul sebagai puncak (palsu) selama dekonvolusi.Selain itu, puncak akibat pembengkokan air bertepatan dengan posisi puncak Amida I dan mungkin memiliki besaran yang sama untuk sampel yang mengandung air dalam jumlah besar, seperti gel berair yang dipelajari di sini.Oleh karena itu, kami tidak berusaha untuk menguraikan puncak Amida I sepenuhnya, dan pengamatan kami hanya boleh dipertimbangkan untuk mendukung metode lain seperti spektroskopi NMR.
Larutan 50 mg/ml NT dan His-NT2RepCT dibuat gel semalaman pada suhu 37°C.Hidrogel kemudian diencerkan dengan 20 mM Tris-HCl (pH 8) hingga konsentrasi 12,5 mg/ml, dikocok dengan baik dan dipipet untuk memecahkan gel.Selanjutnya, hidrogel diencerkan 10 kali dengan 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl sampel diaplikasikan pada kotak tembaga yang dilapisi formvar, dan kelebihan sampel dihilangkan dengan kertas isap.Sampel dicuci dua kali dengan 5 μl air MilliQ dan diwarnai dengan 1% uranil format selama 5 menit.Hapus sisa noda dengan kertas penyerap, lalu keringkan jaringnya.Pencitraan dilakukan pada jaringan ini menggunakan FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN yang beroperasi pada 100 kV.Gambar direkam pada perbesaran x 26.500 dan x 43.000 menggunakan kamera CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Jerman).Untuk setiap sampel (n = 1), 10–15 gambar direkam.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) digunakan untuk analisis gambar dan pengukuran diameter serat (n = 100, serat berbeda).Prism 9 digunakan untuk melakukan uji-t tidak berpasangan (dua sisi).Rata-rata fibril His-NT2RepCT dan NT masing-masing adalah 11,43 (SD 2,035) dan 7,67 (SD 1,389) nm.Interval kepercayaan (95%) adalah -4,246 hingga -3,275.derajat kebebasan = 198, p <0,0001.
80 μl sampel cairan yang mengandung 10 μM thioflavin T (ThT) diukur dalam rangkap tiga (n = 3) dalam kondisi statis menggunakan pelat bawah bening bawah hitam Corning 96-well (Corning Glass 3881, USA).Perbedaan fluoresensi dicatat menggunakan filter eksitasi 440 nm dan filter emisi 480 nm (FLUOStar Galaxy dari BMG Labtech, Offenburg, Jerman).Sinyal ThT tidak jenuh atau padam, karena percobaan dengan konsentrasi ThT yang berbeda dilakukan tanpa mengubah intensitas sinyal.Catat serapan pada 360 nm untuk pengukuran kabut.Untuk percobaan penyemaian, 100 mg/mL gel dibentuk pada suhu 37°C, diresuspensi, dan digunakan untuk penyemaian pada perbandingan molar 5%, 10%, dan 20%.Data dianalisis menggunakan Prism 9.
Cairkan stok His-NT2RepCT dan NT >100 mg/mL di atas es dan saring melalui filter 0,22 µm.Konsentrasi dihitung dengan mengukur serapan pada 280 nm menggunakan Nanodrop.Dalam sumur pelat hitam tidak mengikat (Corning) 96 sumur dengan dasar bening, sampel diencerkan hingga 20 mg/ml dalam 20 mM Tris-HCl pH 8 dan dicampur dengan 5 μM ThT (konsentrasi akhir), total konsentrasi sampel volumenya 50 μl.Sampel dicitrakan setiap 10 menit pada suhu 37 ° C pada mikroskop CellObserver (Zeiss) dengan saluran cahaya yang ditransmisikan dan set filter eksitasi dan emisi FITC untuk pencitraan ThT.Lensa 20x/0,4 digunakan untuk pencitraan.Zen Blue (Zeiss) dan ImageJ (https://imagej.nih.gov/) digunakan untuk analisis gambar.Gel juga dibuat dari larutan NT dan His-NT2RepCT pada konsentrasi 50 mg/mL yang mengandung 20 mM Tris pH 8 dan 5 µM ThT dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 90 menit.Potongan gel dipindahkan ke sumur baru yang mengandung 20 mM Tris, pH 8, dan 5 μM ThT dalam pelat bawah bening 96 hitam yang tidak mengikat.Dapatkan fluoresensi hijau dan gambar bidang terang pada pembesaran 20x/0,4.ImageJ digunakan untuk analisis gambar.
Spektra solusi NMR diperoleh pada 310 K pada spektrometer Bruker Avance Neo 600 MHz yang dilengkapi dengan QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Sampel NMR mengandung 10 mg/mL protein homogen berlabel 13C, 15N, dilarutkan dalam 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (b/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Pergeseran kimia NT2RepCT pada pH 6,7 digunakan untuk menetapkan puncak 23 dalam spektrum 2D 15N-HSQC.
Spektrum NMR (MAS) pemintalan sudut ajaib dari hidrogel berlabel 13C, 15N direkam pada spektrometer Bruker Avance III HD pada 800 MHz yang dilengkapi dengan probe tanpa elektron 13C/15N{1H} 3,2 mm.Suhu sampel dikontrol menggunakan aliran gas suhu variabel pada 277 K. Spektrum resonansi rotasi dipol dua dimensi (DARR)76 dan spektrum penyambungan kembali frekuensi radio (RFDR)77 diperoleh pada frekuensi MAS masing-masing 12,5 kHz dan 20 kHz.Polarisasi silang (CP) dari 1H hingga 13C dilakukan menggunakan jalur linier dari 60,0 hingga 48,0 kHz pada 1H, 61,3/71,6 kHz pada 13C (pada MAS 12,5/20 kHz) dan waktu kontak 0,5–1 ms.Decoupling Spinal6478 pada 73,5 kHz digunakan selama pengumpulan data.Waktu akuisisi adalah 10 milidetik dan penundaan siklus adalah 2,5 detik.Korelasi Cα/Cβ tautan tunggal yang diamati dalam spektrum RFDR ditetapkan berdasarkan karakteristik pergeseran kimia tipe residu dan korelasi tautan ganda dalam spektrum DARR.
Basis data Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) digunakan untuk mengevaluasi kecenderungan flutter dan energi Rosetta untuk NT, NTFlSp, dan NTMiSp.Basis data Zip menghitung Rosetta Energy80, yang menggabungkan beberapa fungsi energi bebas untuk memodelkan dan menganalisis struktur protein.Tingkat energi -23 kkal/mol atau lebih rendah menunjukkan kecenderungan tinggi terjadinya fibrilasi.Energi yang lebih rendah berarti lebih stabilnya dua untai β dalam konformasi ritsleting.Selain itu, algoritma Waltz digunakan untuk memprediksi daerah amiloidogenik di NT, NTFlSp dan NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Larutan protein NT dicampur dengan buffer 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) pada pH 5,5 dan 6,0 untuk menurunkan pH masing-masing menjadi pH 6 dan 7.Konsentrasi protein akhir adalah 100 mg/ml.
Pengukuran dilakukan pada spektrometer CD J-1500 (JASCO, USA) menggunakan kuvet 300 μL dengan jalur optik 0,1 cm.Protein diencerkan hingga 10 μM (n = 1) dalam 20 mM buffer fosfat (pH 8).Untuk menganalisis stabilitas protein dengan adanya garam, protein dianalisis pada konsentrasi yang sama (n = 1) dalam 20 mM buffer fosfat (pH 8) yang masing-masing mengandung 154 mM NaF atau NaCl.Pemindaian suhu dicatat pada 222 nm dari 25°C hingga 95°C dengan laju pemanasan 1°C/menit.Proporsi protein terlipat asli dihitung menggunakan rumus (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Selain itu, lima spektrum dicatat untuk setiap sampel dari 260 nm hingga 190 nm pada 25°C dan setelah pemanasan hingga 95°C.Lima spektrum dirata-ratakan, dihaluskan dan diubah menjadi eliptisitas molar.Data dianalisis menggunakan Prism 9.
Intensitas fluoresensi His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) diukur dalam rangkap tiga (n = 3) dalam pelat Corning 96-sumur dengan dasar transparan hitam (Corning Glass 3881, USA) dalam kondisi statis.Ukur sampel dengan pembaca pelat berbasis fluoresensi dengan panjang gelombang eksitasi 395 nm dan catat emisi pada 509 nm sebelum gelasi dan 2 jam kemudian pada 37°C.Data dianalisis dengan Prism 9.
Kit uji aktivitas nukleosida fosforilase purin (metode fluorometri, Sigma Aldrich) digunakan sesuai dengan instruksi pabrik.Untuk mengukur aktivitas dalam gel dan larutan yang mengandung His-NT-PNP, campurkan 10 ng His-NT-PNP dengan 100 mg/mL NT hingga volume total 2 µL karena gel memberikan sinyal di atas interval deteksi yang ditetapkan.Kontrol untuk gel dan larutan tanpa His-NT-PNP dimasukkan.Pengukuran dilakukan dua kali (n = 2).Setelah aktivitas diukur, campuran reaksi dikeluarkan dan gel difoto untuk memastikan gel tetap utuh selama pengukuran.Data dianalisis menggunakan Prism 9.
Untuk informasi lebih lanjut mengenai desain studi, lihat abstrak studi Alam yang ditautkan ke artikel ini.
Gambar 1 dan 2 menyajikan data awal.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, dan 6, Gambar Tambahan.3, gambar tambahan.5a, d, gambar tambahan.6 dan gambar tambahan.8. Data Data dari penelitian ini disimpan di database Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Data NMR yang diperoleh dalam penelitian ini diposting ke repositori BMRBig dengan entri ID bmrbig36.Struktur GFP dan PNP diambil dari PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. dan Johansson, J. Memutar sutra laba-laba buatan.Kimia Nasional.biologi.11, 309–315 (2015).
Babb, PL dkk.Genom Nephila clavipes menyoroti keragaman gen sutra laba-laba dan ekspresi kompleksnya.Genette Nasional.49, 895–903 (2017).