Komponen kimia tabung kumparan baja tahan karat 304, Struktur ektodomain SPACA6 mengandung superfamili protein yang terkait dengan fusi gamet.

Terima kasih telah mengunjungi Nature.com.Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Slider menampilkan tiga artikel per slide.Gunakan tombol kembali dan berikutnya untuk menelusuri slide, atau tombol pengontrol slide di akhir untuk menelusuri setiap slide.

SPACA6 adalah protein permukaan yang diekspresikan sperma yang sangat penting untuk fusi gamet selama reproduksi seksual mamalia.Terlepas dari peran mendasar ini, fungsi spesifik SPACA6 masih kurang dipahami.Kami menjelaskan struktur kristal domain ekstraseluler SPACA6 pada resolusi 2,2 Å, mengungkapkan protein dua domain yang terdiri dari bundel beruntai empat dan sandwich β mirip Ig yang digabungkan dengan penghubung kuasi-fleksibel.Struktur ini menyerupai IZUMO1, protein terkait fusi gamet lainnya, menjadikan SPACA6 dan IZUMO1 anggota pendiri superfamili protein terkait fertilisasi yang di sini disebut sebagai superfamili IST.Superfamili IST secara struktural ditentukan oleh bundel empat heliks yang dipilin dan sepasang motif CXXC yang terhubung dengan disulfida.Pencarian AlphaFold berbasis struktur pada proteom manusia mengidentifikasi anggota protein tambahan dari keluarga super ini;khususnya, banyak dari protein ini terlibat dalam fusi gamet.Struktur SPACA6 dan hubungannya dengan anggota superfamili IST lainnya memberikan mata rantai yang hilang dalam pengetahuan kita tentang fusi gamet mamalia.
Setiap kehidupan manusia dimulai dengan dua gamet haploid yang terpisah: sperma ayah dan sel telur ibu.Sperma ini adalah pemenang dari proses seleksi yang intens di mana jutaan sel sperma melewati saluran genital wanita, mengatasi berbagai rintangan1 dan menjalani kapasitasi, yang meningkatkan motilitasnya dan proses komponen permukaan2,3,4.Sekalipun sperma dan oosit saling bertemu, prosesnya belum berakhir.Oosit dikelilingi oleh lapisan sel kumulus dan penghalang glikoprotein yang disebut zona pelusida, yang harus dilewati sperma untuk memasuki oosit.Spermatozoa menggunakan kombinasi molekul adhesi permukaan dan enzim yang berhubungan dengan membran dan disekresikan untuk mengatasi hambatan akhir ini5.Molekul dan enzim ini terutama disimpan di membran dalam dan matriks akrosom dan terdeteksi ketika membran luar sperma dilisiskan selama reaksi akrosom6.Langkah terakhir dalam perjalanan intens ini adalah peristiwa fusi sperma-telur, di mana kedua sel menyatukan membrannya menjadi organisme diploid tunggal7.Meskipun proses ini merupakan terobosan dalam reproduksi manusia, interaksi molekuler yang diperlukan masih kurang dipahami.
Selain pembuahan gamet, kimia peleburan dua lapisan ganda lipid telah dipelajari secara ekstensif.Secara umum, fusi membran adalah proses yang tidak menguntungkan secara energetik yang memerlukan katalis protein untuk mengalami perubahan konformasi struktural yang mendekatkan dua membran, memutus kontinuitasnya dan menyebabkan fusi8,9.Katalis protein ini dikenal sebagai fusogen dan telah ditemukan dalam banyak sistem fusi.Mereka diperlukan untuk masuknya virus ke dalam sel inang (misalnya, gp160 pada HIV-1, lonjakan pada virus corona, hemagglutinin pada virus influenza)10,11,12 plasenta (syncytin)13,14,15 dan fusi pembentuk gamet pada eukariota yang lebih rendah ( HAP2/GCS1 pada tumbuhan, protista dan artropoda) 16,17,18,19.Fusogen untuk gamet manusia belum ditemukan, meskipun beberapa protein telah terbukti penting untuk perlekatan dan fusi gamet.CD9 yang diekspresikan oosit, suatu protein transmembran yang diperlukan untuk fusi gamet tikus dan manusia, adalah yang pertama ditemukan 21,22,23.Meskipun fungsi tepatnya masih belum jelas, peranannya dalam adhesi, struktur fokus adhesi pada mikrovili telur, dan/atau lokalisasi protein permukaan oosit yang benar tampaknya mungkin terjadi 24,25,26.Dua protein paling khas yang penting untuk fusi gamet adalah protein sperma IZUMO127 dan protein oosit JUNO28, dan hubungan timbal balik keduanya merupakan langkah penting dalam pengenalan dan adhesi gamet sebelum fusi.Tikus knockout Izumo1 jantan dan tikus knockout Juno betina benar-benar steril, dalam model ini sperma memasuki ruang perivitelline tetapi gamet tidak menyatu.Demikian pula, pertemuan berkurang ketika gamet diobati dengan antibodi anti-IZUMO1 atau JUNO27,29 dalam percobaan fertilisasi in vitro pada manusia.
Baru-baru ini, sekelompok protein ekspresi sperma baru yang secara fenotip mirip dengan IZUMO1 dan JUNO20,30,31,32,33,34,35 telah ditemukan.Protein terkait membran akrosomal sperma 6 (SPACA6) telah diidentifikasi sebagai hal yang penting untuk pembuahan dalam studi mutagenesis murine skala besar.Penyisipan transgen ke dalam gen Spaca6 menghasilkan spermatozoa yang tidak dapat melebur, meskipun spermatozoa ini menginfiltrasi ruang perivitelline 36 .Studi knockout selanjutnya pada tikus menegaskan bahwa Spaca6 diperlukan untuk fusi gamet 30,32 .SPACA6 diekspresikan hampir secara eksklusif di testis dan memiliki pola lokalisasi yang mirip dengan IZUMO1, yaitu di dalam intima spermatozoa sebelum reaksi akrosom, dan kemudian bermigrasi ke daerah ekuator setelah reaksi akrosomal 30,32.Homolog Spaca6 terdapat pada berbagai mamalia dan eukariota lainnya 30 dan pentingnya hal ini bagi fusi gamet manusia telah dibuktikan dengan penghambatan fertilisasi manusia secara in vitro melalui resistensi terhadap SPACA6 30 .Berbeda dengan IZUMO1 dan JUNO, rincian struktur, interaksi, dan fungsi SPACA6 masih belum jelas.
Untuk lebih memahami proses mendasar yang mendasari peleburan sperma dan sel telur manusia, yang akan memungkinkan kita untuk menginformasikan perkembangan masa depan dalam keluarga berencana dan pengobatan kesuburan, kami melakukan studi struktural dan biokimia SPACA6.Struktur kristal domain ekstraseluler SPACA6 menunjukkan bundel empat heliks (4HB) dan domain mirip imunoglobulin (seperti Ig) yang dihubungkan oleh daerah kuasi-fleksibel.Seperti yang diperkirakan dalam penelitian sebelumnya,7,32,37 struktur domain SPACA6 mirip dengan IZUMO1 manusia, dan kedua protein tersebut memiliki motif yang tidak biasa: 4HB dengan permukaan heliks segitiga dan sepasang motif CXXC terkait disulfida.Kami mengusulkan bahwa IZUMO1 dan SPACA6 sekarang mendefinisikan superfamili protein yang lebih besar dan terkait secara struktural yang terkait dengan fusi gamet.Dengan menggunakan fitur-fitur unik pada superfamili, kami melakukan pencarian menyeluruh untuk proteom struktural manusia AlphaFold, mengidentifikasi anggota tambahan dari superfamili ini, termasuk beberapa anggota yang terlibat dalam fusi dan/atau pembuahan gamet.Sekarang tampak bahwa terdapat lipatan struktural umum dan superfamili protein yang terkait dengan fusi gamet, dan struktur kami menyediakan peta molekuler tentang aspek penting mekanisme fusi gamet manusia ini.
SPACA6 adalah protein transmembran single-pass dengan satu glikan terkait-N dan enam ikatan disulfida yang diduga (Gambar S1a dan S2).Kami mengekspresikan domain ekstraseluler SPACA6 manusia (residu 27-246) dalam sel Drosophila S2 dan memurnikan protein menggunakan afinitas nikel, pertukaran kation, dan kromatografi eksklusi ukuran (Gbr. S1b).Ektodomain SPACA6 yang dimurnikan sangat stabil dan homogen.Analisis menggunakan kromatografi eksklusi ukuran dikombinasikan dengan hamburan cahaya poligonal (SEC-MALS) mengungkapkan satu puncak dengan berat molekul terhitung 26,2 ± 0,5 kDa (Gbr. S1c).Hal ini konsisten dengan ukuran ektodomain monomer SPACA6, yang menunjukkan bahwa oligomerisasi tidak terjadi selama pemurnian.Selain itu, spektroskopi dichroism melingkar (CD) mengungkapkan struktur campuran α/β dengan titik leleh 51,3 °C (Gbr. S1d,e).Dekonvolusi spektrum CD mengungkapkan 38,6% elemen α-heliks dan 15,8% β-stranded (Gambar S1d).
Ektodomain SPACA6 dikristalisasi menggunakan penyemaian matriks acak38 menghasilkan kumpulan data dengan resolusi 2,2 Å (Tabel 1 dan Gambar S3).Menggunakan kombinasi substitusi molekuler berbasis fragmen dan data pentahapan SAD dengan paparan bromida untuk penentuan struktur (Tabel 1 dan Gambar S4), model akhir yang disempurnakan terdiri dari residu 27–246.Pada saat struktur ditentukan, belum ada struktur eksperimental atau AlphaFold yang tersedia.Ektodomain SPACA6 berukuran 20 Å × 20 Å × 85 Å, terdiri dari tujuh heliks dan sembilan untai β, dan memiliki lipatan tersier memanjang yang distabilkan oleh enam ikatan disulfida (Gbr. 1a, b).Kerapatan elektron yang lemah pada ujung rantai samping Asn243 menunjukkan bahwa residu ini merupakan glikosilasi terkait-N.Strukturnya terdiri dari dua domain: bundel empat heliks terminal-N (4HB) dan domain mirip Ig terminal-C dengan daerah engsel perantara di antara keduanya (Gbr. 1c).
struktur domain ekstraseluler SPACA6.Diagram strip domain ekstraseluler SPACA6, warna rantai dari terminal N ke C dari biru tua ke merah tua.Sistein yang terlibat dalam ikatan disulfida disorot dalam warna magenta.b Topologi domain ekstraseluler SPACA6.Gunakan skema warna yang sama seperti pada Gambar 1a.c domain ekstraseluler SPACA6.Bagan strip domain mirip 4HB, engsel, dan Ig masing-masing berwarna oranye, hijau, dan biru.Lapisan-lapisannya tidak digambar berdasarkan skala.
Domain 4HB dari SPACA6 mencakup empat heliks utama (heliks 1-4), yang disusun dalam bentuk heliks heliks (Gbr. 2a), bergantian antara interaksi antiparalel dan paralel (Gbr. 2b).Heliks putaran tunggal tambahan kecil (heliks 1′) diletakkan tegak lurus terhadap bundel, membentuk segitiga dengan heliks 1 dan 2. Segitiga ini sedikit terdeformasi dalam kemasan heliks-pilin dari kemasan heliks 3 dan 4 yang relatif padat ( Gambar 2a).
Bagan strip terminal-N 4HB.b Tampak atas kumpulan empat heliks, masing-masing heliks disorot dengan warna biru tua di ujung N dan merah tua di ujung C.c Diagram roda spiral dari atas ke bawah untuk 4HB, dengan setiap residu ditampilkan sebagai lingkaran yang diberi label dengan kode asam amino satu huruf;hanya empat asam amino di bagian atas roda yang diberi nomor.Residu non polar berwarna kuning, residu polar tidak bermuatan berwarna hijau, residu bermuatan positif berwarna biru, dan residu bermuatan negatif berwarna merah.d Wajah segitiga dari domain 4HB, dengan 4HB berwarna oranye dan engsel berwarna hijau.Kedua sisipan menunjukkan ikatan disulfida berbentuk batang.
4HB terkonsentrasi pada inti hidrofobik bagian dalam yang sebagian besar terdiri dari residu alifatik dan aromatik (Gbr. 2c).Inti mengandung ikatan disulfida antara Cys41 dan Cys55 yang menghubungkan heliks 1 dan 2 bersama-sama dalam segitiga atas (Gbr. 2d).Dua ikatan disulfida tambahan terbentuk antara motif CXXC di Helix 1′ dan motif CXXC lainnya yang ditemukan di ujung jepit rambut β di daerah engsel (Gbr. 2d).Residu arginin konservatif dengan fungsi yang tidak diketahui (Arg37) terletak di dalam segitiga berongga yang dibentuk oleh heliks 1′, 1, dan 2. Atom karbon alifatik Cβ, Cγ, dan Cδ Arg37 berinteraksi dengan inti hidrofobik, dan gugus guanidinnya bergerak secara siklis antara heliks 1′ dan 1 melalui interaksi antara tulang punggung Thr32 dan rantai samping (Gbr. S5a,b).Tyr34 meluas ke dalam rongga meninggalkan dua rongga kecil di mana Arg37 dapat berinteraksi dengan pelarut.
Domain β-sandwich mirip Ig adalah superfamili besar protein yang memiliki ciri umum yang sama yaitu dua atau lebih lembaran β amfipatik multi-untai yang berinteraksi melalui inti hidrofobik 39. Domain mirip Ig terminal-C pada SPACA6 memiliki pola yang sama dan terdiri dari dua lapisan (Gbr. S6a).Lembar 1 adalah lembaran β yang terdiri dari empat helai (untai D, F, H, dan I) dengan helai F, H, dan I membentuk susunan antiparalel, dan helai I dan D melakukan interaksi paralel.Tabel 2 adalah lembaran beta untai ganda anti-paralel kecil (untaian E dan G).Ikatan disulfida internal diamati antara ujung C dari rantai E dan pusat rantai H (Cys170-Cys226) (Gbr. S6b).Ikatan disulfida ini analog dengan ikatan disulfida pada domain β-sandwich imunoglobulin40,41.
Lembaran β empat untai berputar sepanjang keseluruhannya, membentuk tepi asimetris yang berbeda dalam bentuk dan elektrostatika.Tepi yang lebih tipis adalah permukaan lingkungan hidrofobik datar yang menonjol dibandingkan dengan permukaan yang tidak rata dan beragam secara elektrostatik di SPACA6 (Gbr. S6b, c).Lingkaran gugus karbonil/amino tulang punggung yang terbuka dan rantai samping polar mengelilingi permukaan hidrofobik (Gbr. S6c).Margin yang lebih luas ditutupi oleh segmen heliks tertutup yang menghalangi bagian terminal-N dari inti hidrofobik dan membentuk tiga ikatan hidrogen dengan kelompok polar terbuka dari tulang punggung rantai F (Gbr. S6d).Bagian terminal-C dari tepi ini membentuk kantong besar dengan inti hidrofobik yang terbuka sebagian.Kantong tersebut dikelilingi oleh muatan positif karena tiga set residu arginin ganda (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 dan Arg212-Arg214) dan histidin sentral (His220) (Gambar S6e).
Daerah engsel adalah segmen pendek antara domain heliks dan domain mirip Ig, yang terdiri dari satu lapisan β beruntai tiga antiparalel (untai A, B, dan C), heliks 310 kecil, dan beberapa segmen heliks acak panjang.(Gbr. S7).Jaringan kontak kovalen dan elektrostatik di daerah engsel tampaknya menstabilkan orientasi antara 4HB dan domain mirip Ig.Jaringan dapat dibagi menjadi tiga bagian.Bagian pertama mencakup dua motif CXXC (27CXXC30 dan 139CXXC142) yang membentuk sepasang ikatan disulfida antara β-hairpin di engsel dan heliks 1′ di 4HB.Bagian kedua mencakup interaksi elektrostatis antara domain mirip Ig dan engsel.Glu132 di engselnya membentuk jembatan garam dengan Arg233 di domain mirip Ig dan Arg135 di engselnya.Bagian ketiga mencakup ikatan kovalen antara domain mirip Ig dan daerah engsel.Dua ikatan disulfida (Cys124-Cys147 dan Cys128-Cys153) menghubungkan loop engsel ke penghubung yang distabilkan oleh interaksi elektrostatik antara Gln131 dan gugus fungsi tulang punggung, memungkinkan akses ke domain mirip Ig pertama.rantai.
Struktur ektodomain SPACA6 dan struktur individu dari 4HB dan domain mirip Ig digunakan untuk mencari catatan yang serupa secara struktural dalam database protein 42 .Kami mengidentifikasi kecocokan dengan skor Dali Z yang tinggi, standar deviasi yang kecil, dan skor LALI yang besar (yang terakhir adalah jumlah residu yang setara secara struktural).Sementara 10 hit pertama dari pencarian ektodomain lengkap (Tabel S1) memiliki skor Z yang dapat diterima> 842, pencarian untuk domain mirip 4HB atau Ig saja menunjukkan bahwa sebagian besar hit ini hanya berhubungan dengan sandwich β.lipatan di mana-mana yang ditemukan di banyak protein.Ketiga pencarian di Dali hanya menghasilkan satu hasil: IZUMO1.
Telah lama dikemukakan bahwa SPACA6 dan IZUMO1 memiliki kesamaan struktural7,32,37.Meskipun ektodomain dari dua protein terkait fusi gamet ini hanya berbagi 21% identitas urutan (Gambar S8a), bukti kompleks, termasuk pola ikatan disulfida yang dilestarikan dan prediksi domain mirip Ig terminal-C di SPACA6, memungkinkan upaya awal untuk membangun sebuah model homologi mouse A SPACA6 menggunakan IZUMO1 sebagai template37.Struktur kami mengkonfirmasi prediksi ini dan menunjukkan tingkat kemiripan yang sebenarnya.Faktanya, struktur SPACA6 dan IZUMO137,43,44 berbagi arsitektur dua domain yang sama (Gbr. S8b) dengan domain β-sandwich mirip 4HB dan Ig yang dihubungkan oleh wilayah engsel (Gbr. S8c).
IZUMO1 dan SPACA6 4HB memiliki perbedaan umum dari bundel spiral konvensional.4HB yang khas, seperti yang ditemukan dalam kompleks protein SNARE yang terlibat dalam fusi endosom 45,46, memiliki heliks dengan jarak yang sama yang mempertahankan kelengkungan konstan di sekitar sumbu pusat 47. Sebaliknya, domain heliks di IZUMO1 dan SPACA6 terdistorsi, dengan kelengkungan variabel dan pengepakan tidak rata (Gambar S8d).Pelintiran, mungkin disebabkan oleh segitiga yang dibentuk oleh heliks 1′, 1 dan 2, dipertahankan dalam IZUMO1 dan SPACA6 dan distabilkan oleh motif CXXC yang sama pada heliks 1′.Namun, ikatan disulfida tambahan yang ditemukan di SPACA6 (Cys41 dan Cys55 secara kovalen menghubungkan heliks 1 dan 2 di atas) menciptakan puncak yang lebih tajam di puncak segitiga, membuat SPACA6 lebih terpuntir dibandingkan IZUMO1, dengan segitiga rongga yang lebih menonjol.Selain itu, IZUMO1 kekurangan Arg37 yang diamati di tengah rongga ini di SPACA6.Sebaliknya, IZUMO1 memiliki inti hidrofobik yang lebih khas berupa residu alifatik dan aromatik.
IZUMO1 memiliki domain mirip Ig yang terdiri dari β-sheet beruntai ganda dan beruntai lima43.Untaian ekstra di IZUMO1 menggantikan kumparan di SPACA6, yang berinteraksi dengan untai F untuk membatasi ikatan hidrogen tulang punggung dalam untai.Hal yang menarik dari perbandingan ini adalah prediksi muatan permukaan domain mirip Ig dari kedua protein tersebut.Permukaan IZUMO1 bermuatan lebih negatif dibandingkan permukaan SPACA6.Biaya tambahan terletak di dekat terminal-C yang menghadap membran sperma.Di SPACA6, daerah yang sama lebih netral atau bermuatan positif (Gbr. S8e).Misalnya, permukaan hidrofobik (tepi lebih tipis) dan lubang bermuatan positif (tepi lebih lebar) di SPACA6 bermuatan negatif di IZUMO1.
Meskipun hubungan dan elemen struktur sekunder antara IZUMO1 dan SPACA6 terpelihara dengan baik, penyelarasan struktural domain mirip Ig menunjukkan bahwa kedua domain berbeda dalam orientasi umumnya relatif satu sama lain (Gbr. S9).Bundel spiral IZUMO1 melengkung di sekitar sandwich β, menciptakan bentuk “bumerang” yang telah dijelaskan sebelumnya pada sekitar 50° dari sumbu pusat.Sebaliknya, berkas heliks di SPACA6 dimiringkan sekitar 10° ke arah yang berlawanan.Perbedaan orientasi ini kemungkinan besar disebabkan oleh perbedaan daerah engselnya.Pada tingkat urutan primer, IZUMO1 dan SPACA6 memiliki sedikit kesamaan urutan pada engsel, kecuali residu sistein, glisin, dan asam aspartat.Akibatnya, ikatan hidrogen dan jaringan elektrostatis menjadi sangat berbeda.Elemen struktur sekunder lembaran β digunakan bersama oleh IZUMO1 dan SPACA6, meskipun rantai di IZUMO1 jauh lebih panjang dan heliks 310 (heliks 5) unik untuk SPACA6.Perbedaan ini menghasilkan orientasi domain yang berbeda untuk dua protein yang serupa.
Pencarian server Dali kami mengungkapkan bahwa SPACA6 dan IZUMO1 adalah satu-satunya dua struktur yang ditentukan secara eksperimental yang disimpan dalam database protein yang memiliki lipatan 4HB khusus ini (Tabel S1).Baru-baru ini, DeepMind (Alphabet/Google) telah mengembangkan AlphaFold, sistem berbasis jaringan saraf yang dapat secara akurat memprediksi struktur 3D protein dari rangkaian primer48.Tak lama setelah kami memecahkan struktur SPACA6, database AlphaFold dirilis, menyediakan model struktur prediktif yang mencakup 98,5% dari seluruh protein dalam proteom manusia48,49.Dengan menggunakan struktur SPACA6 kami yang terselesaikan sebagai model pencarian, pencarian homologi struktural untuk model dalam proteom manusia AlphaFold mengidentifikasi kandidat dengan kemungkinan kesamaan struktural dengan SPACA6 dan IZUMO1.Mengingat keakuratan AlphaFold yang luar biasa dalam memprediksi SPACA6 (Gbr. S10a)—terutama ektodomain 1,1 Å rms dibandingkan dengan struktur terselesaikan (Gbr. S10b)—kami dapat yakin bahwa kecocokan SPACA6 yang teridentifikasi kemungkinan besar akurat.
Sebelumnya, PSI-BLAST mencari cluster IZUMO1 dengan tiga protein terkait sperma lainnya: IZUMO2, IZUMO3, dan IZUMO450.AlphaFold memperkirakan bahwa protein keluarga IZUMO ini terlipat ke dalam domain 4HB dengan pola ikatan disulfida yang sama dengan IZUMO1 (Gambar 3a dan S11), meskipun mereka tidak memiliki domain mirip Ig.Dihipotesiskan bahwa IZUMO2 dan IZUMO3 adalah protein membran satu sisi yang mirip dengan IZUMO1, sedangkan IZUMO4 tampaknya disekresikan.Fungsi protein IZUMO 2, 3, dan 4 dalam fusi gamet belum ditentukan.IZUMO3 diketahui berperan dalam biogenesis akrosom selama perkembangan sperma51 dan protein IZUMO ditemukan membentuk kompleks50.Konservasi protein IZUMO pada mamalia, reptil, dan amfibi menunjukkan bahwa fungsi potensialnya konsisten dengan protein terkait fusi gamet lainnya yang diketahui, seperti DCST1/2, SOF1, dan FIMP.
Diagram arsitektur domain superfamili IST, dengan domain mirip 4HB, engsel, dan Ig masing-masing disorot dalam warna oranye, hijau, dan biru.IZUMO4 memiliki wilayah terminal C unik yang terlihat berwarna hitam.Ikatan disulfida terkonfirmasi dan dugaan masing-masing ditunjukkan oleh garis padat dan putus-putus.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), dan TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ditampilkan dalam rentang warna yang sama dengan panel A. Ikatan disulfida ditunjukkan dalam warna magenta.Heliks transmembran TMEM95, IZUMO2 dan IZUMO3 tidak ditampilkan.
Berbeda dengan protein IZUMO, protein SPACA lainnya (yaitu, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, dan SPACA9) dianggap berbeda secara struktural dari SPACA6 (Gbr. S12).Hanya SPACA9 yang memiliki 4HB, tetapi diperkirakan tidak memiliki orientasi paralel-anti-paralel atau ikatan disulfida yang sama seperti SPACA6.Hanya SPACA1 yang memiliki domain mirip Ig serupa.AlphaFold memperkirakan bahwa SPACA3, SPACA4, dan SPACA5 memiliki struktur yang sangat berbeda dari SPACA6.Menariknya, SPACA4 juga diketahui berperan dalam pembuahan, namun lebih berperan dibandingkan SPACA6, justru memfasilitasi interaksi antara sperma dan oosit zona pellucida52.
Pencarian AlphaFold kami menemukan kecocokan lain untuk IZUMO1 dan SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, sebuah protein transmembran khusus sperma, membuat tikus jantan menjadi tidak subur ketika diablasi 32,33.Spermatozoa yang kekurangan TMEM95 memiliki morfologi, motilitas, dan kemampuan menembus zona pelusida yang normal serta berikatan dengan membran sel telur, namun tidak dapat berfusi dengan membran oosit.Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa TMEM95 memiliki kesamaan struktural dengan IZUMO133.Memang, model AlphaFold mengkonfirmasi bahwa TMEM95 adalah 4HB dengan pasangan motif CXXC yang sama dengan IZUMO1 dan SPACA6 dan ikatan disulfida tambahan yang sama antara heliks 1 dan 2 ditemukan di SPACA6 (Gbr. 3a dan S11).Meskipun TMEM95 tidak memiliki domain mirip Ig, ia memiliki wilayah dengan pola ikatan disulfida yang mirip dengan wilayah engsel SPACA6 dan IZUMO1 (Gbr. 3b).Pada saat naskah ini diterbitkan, server pracetak melaporkan struktur TMEM95, mengonfirmasi hasil AlphaFold53.TMEM95 sangat mirip dengan SPACA6 dan IZUMO1 dan secara evolusi sudah dilestarikan pada amfibi (Gbr. 4 dan S13).
Pencarian PSI-BLAST menggunakan database NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, dan SOF1 untuk menentukan posisi urutan ini dalam pohon kehidupan.Jarak antar titik cabang tidak ditampilkan dalam skala.
Kesamaan struktural keseluruhan yang mencolok antara SPACA6 dan IZUMO1 menunjukkan bahwa mereka adalah anggota pendiri superfamili struktural yang dilestarikan yang mencakup protein TMEM95 dan IZUMO 2, 3, dan 4.anggota yang dikenal: IZUMO1, SPACA6 dan TMEM95.Karena hanya sedikit anggota yang memiliki domain mirip Ig, ciri khas superfamili IST adalah domain 4HB, yang memiliki fitur unik yang umum pada semua protein berikut: 1) Melingkar 4HB dengan heliks yang tersusun dalam pergantian anti-paralel/paralel (Gbr. .5a), 2) bundel memiliki permukaan segitiga yang terdiri dari dua heliks di dalam bundel dan heliks vertikal ketiga (Gbr. area kunci (Gbr. 5c). Motif CXXC, yang ditemukan pada protein mirip tioredoksin, diketahui berfungsi sebagai sensor redoks 54,55,56 , sedangkan motif pada anggota keluarga IST dapat dikaitkan dengan protein disulfida isomerase seperti ERp57 dalam fusi gamet. Peran terkait 57,58.
Anggota superfamili IST ditentukan oleh tiga ciri khas domain 4HB: empat heliks bergantian antara orientasi paralel dan antiparalel, permukaan bundel heliks ba-segitiga, dan motif ganda ca CXXC yang terbentuk di antara molekul-molekul kecil.) Heliks terminal-N (oranye) dan daerah engsel β-jepit rambut (hijau).
Mengingat kesamaan antara SPACA6 dan IZUMO1, kemampuan SPACA6 untuk mengikat IZUMO1 atau JUNO diuji.Interferometri biolayer (BLI) adalah metode pengikatan berbasis kinetik yang sebelumnya telah digunakan untuk mengukur interaksi antara IZUMO1 dan JUNO.Setelah inkubasi sensor berlabel biotin dengan IZUMO1 sebagai umpan dengan analit JUNO konsentrasi tinggi, sinyal kuat terdeteksi (Gambar S14a), menunjukkan perubahan yang disebabkan oleh pengikatan pada ketebalan biomaterial yang menempel pada ujung sensor.Sinyal serupa (yaitu, JUNO digabungkan ke sensor sebagai umpan terhadap analit IZUMO1) (Gbr. S14b).Tidak ada sinyal yang terdeteksi ketika SPACA6 digunakan sebagai analit terhadap IZUMO1 yang terikat sensor atau JUNO yang terikat sensor (Gambar S14a,b).Tidak adanya sinyal ini menunjukkan bahwa domain ekstraseluler SPACA6 tidak berinteraksi dengan domain ekstraseluler IZUMO1 atau JUNO.
Karena uji BLI didasarkan pada biotinilasi residu lisin bebas pada protein umpan, modifikasi ini dapat mencegah pengikatan jika residu lisin terlibat dalam interaksi.Selain itu, orientasi pengikatan relatif terhadap sensor dapat menciptakan hambatan sterik, sehingga pengujian pull-down konvensional juga dilakukan pada ektodomain SPACA6, IZUMO1 dan JUNO rekombinan.Meskipun demikian, SPACA6 tidak mengendap dengan IZUMO1 yang diberi tag-Nya atau JUNO yang diberi tag-Nya (Gbr. S14c,d), menunjukkan tidak ada interaksi yang konsisten dengan yang diamati dalam percobaan BLI.Sebagai kontrol positif, kami mengkonfirmasi interaksi JUNO dengan label IZUMO1-Nya (Gambar S14e dan S15).
Terlepas dari kesamaan struktural antara SPACA6 dan IZUMO1, ketidakmampuan SPACA6 untuk mengikat JUNO tidaklah mengejutkan.Permukaan IZUMO1 manusia memiliki lebih dari 20 residu yang berinteraksi dengan JUNO, termasuk residu dari masing-masing tiga wilayah (walaupun sebagian besar terletak di wilayah engsel) (Gbr. S14f).Dari residu tersebut, hanya satu yang disimpan dalam SPACA6 (Glu70).Sementara banyak substitusi residu mempertahankan sifat biokimia aslinya, residu penting Arg160 di IZUMO1 digantikan oleh Asp148 bermuatan negatif di SPACA6;penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa mutasi Arg160Glu pada IZUMO1 hampir sepenuhnya menghilangkan ikatan dengan JUNO43.Selain itu, perbedaan orientasi domain antara IZUMO1 dan SPACA6 secara signifikan meningkatkan luas permukaan situs pengikatan JUNO di wilayah setara pada SPACA6 (Gbr. S14g).
Meskipun SPACA6 diketahui membutuhkan fusi gamet dan kemiripannya dengan IZUMO1, SPACA6 tampaknya tidak memiliki fungsi pengikatan JUNO yang setara.Oleh karena itu, kami berupaya menggabungkan data struktural kami dengan bukti penting yang diberikan oleh biologi evolusi.Penyelarasan urutan homolog SPACA6 menunjukkan konservasi struktur umum di luar mamalia.Misalnya, residu sistein terdapat bahkan pada amfibi yang berkerabat jauh (Gbr. 6a).Menggunakan server ConSurf, beberapa data retensi penyelarasan urutan dari 66 urutan dipetakan ke permukaan SPACA6.Jenis analisis ini dapat menunjukkan residu mana yang telah dilestarikan selama evolusi protein dan dapat menunjukkan daerah permukaan mana yang berperan dalam fungsinya.
a Penyelarasan urutan ektodomain SPACA6 dari 12 spesies berbeda yang disiapkan menggunakan CLUSTAL OMEGA.Menurut analisis ConSurf, posisi paling konservatif ditandai dengan warna biru.Residu sistein disorot dengan warna merah.Batas domain dan elemen struktur sekunder ditampilkan di bagian atas perataan, dengan panah menunjukkan untai β dan gelombang menunjukkan heliks.Pengidentifikasi Akses NCBI yang berisi urutan tersebut adalah: manusia (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), monyet capuchin (Cebus meniru, XP_017359366), kuda (Equus caballus, XP_023506102), paus pembunuh (Orcinus orca3_23 XP_032_0 34) .), domba (Ovis aries, XP_014955560), gajah (Loxodonta africana, XP_010585293), anjing (Canis lupus familyis, XP_025277208), tikus (Mus musculus, NP_001156381), Setan Tasmania (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), Platipus, 8) , 61_89 dan Katak (Bufo bufo, XP_040282113).Penomorannya berdasarkan urutan manusia.b Representasi permukaan struktur SPACA6 dengan 4HB di bagian atas dan domain mirip Ig di bagian bawah, warna berdasarkan perkiraan konservasi dari server ConSurf.Bagian yang paling awet diberi warna biru, bagian yang paling awet diberi warna putih, dan yang paling sedikit diawetkan diberi warna kuning.sistein ungu.Tiga patch permukaan yang menunjukkan tingkat perlindungan yang tinggi ditunjukkan pada sisipan berlabel patch 1, 2 dan 3. Kartun 4HB ditampilkan pada sisipan di kanan atas (skema warna yang sama).
Struktur SPACA6 memiliki tiga wilayah permukaan yang sangat terkonservasi (Gbr. 6b).Patch 1 mencakup 4HB dan wilayah engsel dan berisi dua jembatan disulfida CXXC yang dilestarikan, jaringan engsel Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Gbr. S7), dan tiga residu aromatik luar yang dilestarikan (Phe31, Tyr73, Phe137)).tepi yang lebih luas dari domain mirip Ig (Gbr. S6e), yang mewakili beberapa residu bermuatan positif pada permukaan sperma.Menariknya, patch ini mengandung epitop antibodi yang sebelumnya terbukti mengganggu fungsi SPACA6 30.Wilayah 3 mencakup engsel dan satu sisi domain mirip Ig;wilayah ini mengandung prolin yang dilestarikan (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) dan residu polar/bermuatan yang menghadap ke luar.Anehnya, sebagian besar residu pada permukaan 4HB sangat bervariasi (Gambar 6b), meskipun lipatan tersebut dipertahankan di seluruh homolog SPACA6 (seperti yang ditunjukkan oleh konservatisme inti bundel hidrofobik) dan di luar superfamili IST.
Meskipun ini adalah wilayah terkecil di SPACA6 dengan elemen struktur sekunder paling sedikit yang terdeteksi, banyak sisa wilayah engsel (termasuk wilayah 3) sangat terkonservasi di antara homolog SPACA6, yang mungkin menunjukkan bahwa orientasi ikatan heliks dan sandwich β berperan.sebagai seorang konservatif.Namun, meskipun terdapat ikatan hidrogen dan jaringan elektrostatis yang luas di wilayah engsel SPACA6 dan IZUMO1, bukti fleksibilitas intrinsik dapat dilihat dalam penyelarasan beberapa struktur IZUMO137,43,44 yang diizinkan.Penyelarasan masing-masing domain tumpang tindih dengan baik, tetapi orientasi domain relatif satu sama lain bervariasi dari 50° hingga 70° dari sumbu pusat (Gbr. S16).Untuk memahami dinamika konformasi SPACA6 dalam larutan, percobaan SAXS dilakukan (Gbr. S17a,b).Rekonstruksi ab initio dari ektodomain SPACA6 sesuai dengan struktur kristal batang (Gbr. S18), meskipun plot Kratky menunjukkan beberapa tingkat fleksibilitas (Gbr. S17b).Konformasi ini kontras dengan IZUMO1, di mana protein yang tidak terikat mengambil bentuk bumerang baik dalam kisi maupun dalam larutan43.
Untuk secara spesifik mengidentifikasi wilayah fleksibel, spektroskopi massa pertukaran hidrogen-deuterium (H-DXMS) dilakukan pada SPACA6 dan dibandingkan dengan data yang sebelumnya diperoleh pada IZUMO143 (Gambar 7a,b).SPACA6 jelas lebih fleksibel daripada IZUMO1, sebagaimana dibuktikan dengan pertukaran deuterium yang lebih tinggi di seluruh struktur setelah pertukaran 100.000 detik.Pada kedua struktur, bagian terminal-C pada daerah engsel menunjukkan tingkat pertukaran yang tinggi, yang mungkin memungkinkan rotasi terbatas dari domain mirip 4HB dan Ig relatif satu sama lain.Menariknya, bagian terminal-C dari engsel SPACA6, yang terdiri dari residu 147CDLPLDCP154, adalah wilayah yang sangat dilestarikan 3 (Gambar 6b), mungkin menunjukkan bahwa fleksibilitas antardomain adalah fitur SPACA6 yang dilestarikan secara evolusioner.Menurut analisis fleksibilitas, data lelehan termal CD menunjukkan bahwa SPACA6 (Tm = 51,2°C) kurang stabil dibandingkan IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Gbr. S1e dan S19).
gambar H-DXMS dari SPACA6 dan b IZUMO1.Persentase pertukaran deuterium ditentukan pada titik waktu yang ditentukan.Tingkat pertukaran hidrogen-deuterium ditunjukkan dengan warna pada skala gradien dari biru (10%) hingga merah (90%).Kotak hitam mewakili area pertukaran yang tinggi.Batas-batas domain 4HB, engsel dan mirip Ig yang diamati dalam struktur kristal ditunjukkan di atas urutan primer.Tingkat pertukaran deuterium pada 10 detik, 1000 detik, dan 100.000 detik diplot pada diagram strip yang ditumpangkan pada permukaan molekul transparan SPACA6 dan IZUMO1.Bagian struktur dengan tingkat pertukaran deuterium di bawah 50% berwarna putih.Area di atas 50% pertukaran H-DXMS diwarnai dalam skala gradien.
Penggunaan strategi genetik knockout gen CRISPR/Cas9 dan tikus telah menghasilkan identifikasi beberapa faktor penting untuk pengikatan dan fusi sperma dan sel telur.Terlepas dari interaksi struktur IZUMO1-JUNO dan CD9 yang berkarakter baik, sebagian besar protein yang terkait dengan fusi gamet tetap membingungkan secara struktural dan fungsional.Karakterisasi biofisik dan struktural SPACA6 adalah bagian lain dari teka-teki adhesi/fusi molekuler selama pembuahan.
SPACA6 dan anggota superfamili IST lainnya tampaknya sangat terkonservasi pada mamalia serta individu burung, reptil, dan amfibi;bahkan, SPACA6 diperkirakan diperlukan untuk pembuahan pada ikan zebra 59. Distribusi ini mirip dengan protein terkait fusi gamet lain yang diketahui seperti DCST134, DCST234, FIMP31, dan SOF132, yang menunjukkan bahwa faktor-faktor ini kekurangan HAP2 (juga dikenal sebagai protein GCS1) yang bertanggung jawab atas aktivitas katalitik banyak protista., tumbuhan, dan arthropoda.Protein fusi yang dibuahi 60, 61. Meskipun terdapat kesamaan struktural yang kuat antara SPACA6 dan IZUMO1, hilangnya gen yang mengkode salah satu protein ini mengakibatkan infertilitas pada tikus jantan, yang menunjukkan bahwa fungsinya dalam fusi gamet tidak terduplikasi..Secara lebih luas, tidak ada protein sperma yang diperlukan untuk fase adhesi fusi yang berlebihan.
Masih menjadi pertanyaan terbuka apakah SPACA6 (dan anggota superfamili IST lainnya) berpartisipasi dalam persimpangan antargame, membentuk jaringan intragame untuk merekrut protein penting ke titik fusi, atau bahkan mungkin bertindak sebagai fusogen yang sulit dipahami.Studi ko-imunopresipitasi dalam sel HEK293T mengungkapkan interaksi antara IZUMO1 panjang penuh dan SPACA632.Namun, ektodomain rekombinan kami tidak berinteraksi secara in vitro, menunjukkan bahwa interaksi yang terlihat pada Noda et al.keduanya dihapus dalam konstruksi (perhatikan ekor sitoplasma IZUMO1, yang terbukti tidak diperlukan untuk pembuahan62).Alternatifnya, IZUMO1 dan/atau SPACA6 mungkin memerlukan lingkungan pengikatan spesifik yang tidak dapat direproduksi secara in vitro, seperti konformasi yang spesifik secara fisiologis atau kompleks molekul yang mengandung protein lain (dikenal atau belum ditemukan).Meskipun ektodomain IZUMO1 diyakini memediasi perlekatan spermatozoa ke sel telur di ruang perivitelline, tujuan dari ektodomain SPACA6 tidak jelas.
Struktur SPACA6 mengungkapkan beberapa permukaan yang dilestarikan yang mungkin terlibat dalam interaksi protein-protein.Bagian yang dilestarikan dari daerah engsel yang berbatasan langsung dengan motif CXXC (disebut Patch 1 di atas) memiliki beberapa residu aromatik yang menghadap ke luar yang sering dikaitkan dengan interaksi hidrofobik dan penumpukan π antar biomolekul.Sisi lebar domain mirip Ig (wilayah 2) membentuk alur bermuatan positif dengan residu Arg dan His yang sangat terkonservasi, dan antibodi terhadap wilayah ini sebelumnya telah digunakan untuk memblokir fusi gamet 30 .Antibodi ini mengenali epitop linier 212RIRPAQLTHRGTFS225, yang memiliki tiga dari enam residu arginin dan His220 yang sangat terkonservasi.Tidak jelas apakah disfungsi ini disebabkan oleh penyumbatan residu tertentu atau seluruh wilayah.Lokasi celah di dekat terminal-C dari sandwich β menunjukkan interaksi cis dengan protein sperma di sekitarnya, tetapi tidak dengan protein oosit.Lebih jauh lagi, retensi jalinan kaya prolin yang sangat fleksibel (situs 3) di dalam engsel mungkin merupakan tempat interaksi protein-protein atau, lebih mungkin, menunjukkan retensi fleksibilitas antara dua domain.Gender penting untuk peran SPACA6 yang tidak diketahui.perpaduan gamet.
SPACA6 memiliki sifat protein adhesi antar sel, termasuk sandwich β mirip Ig.Banyak protein perekat (misalnya, cadherin, integrin, adhesin, dan IZUMO1) memiliki satu atau lebih domain β-sandwich yang memperluas protein dari membran sel ke target lingkungannya63,64,65.Domain mirip Ig dari SPACA6 juga mengandung motif yang biasa ditemukan pada sandwich β adhesi dan kohesi: doublet untaian paralel di ujung sandwich β, yang dikenal sebagai penjepit mekanis66.Motif ini diyakini meningkatkan ketahanan terhadap gaya geser, yang bermanfaat bagi protein yang terlibat dalam interaksi antar sel.Namun, meskipun memiliki kemiripan dengan adhesin, saat ini tidak ada bukti bahwa SPACA6 berinteraksi dengan putih telur.Ektodomain SPACA6 tidak dapat berikatan dengan JUNO, dan sel HEK293T yang mengekspresikan SPACA6, seperti yang ditunjukkan di sini, hampir tidak berinteraksi dengan oosit yang tidak memiliki zona 32.Jika SPACA6 membentuk ikatan intergametik, interaksi ini mungkin memerlukan modifikasi pasca-translasi atau distabilkan oleh protein sperma lainnya.Untuk mendukung hipotesis terakhir, spermatozoa yang kekurangan IZUMO1 berikatan dengan oosit, menunjukkan bahwa molekul selain IZUMO1 terlibat dalam langkah adhesi gamet 27 .
Banyak protein fusi virus, seluler, dan perkembangan memiliki sifat yang memprediksi fungsinya sebagai fusogen.Misalnya, glikoprotein fusi virus (kelas I, II dan III) memiliki peptida atau loop fusi hidrofobik di ujung protein yang dimasukkan ke dalam membran inang.Peta hidrofilisitas IZUMO143 dan struktur (ditentukan dan diprediksi) superfamili IST tidak menunjukkan peptida fusi hidrofobik yang jelas.Jadi, jika ada protein dalam superfamili IST yang berfungsi sebagai fusogen, maka protein tersebut melakukannya dengan cara yang berbeda dari contoh lain yang diketahui.
Kesimpulannya, fungsi anggota superfamili protein IST yang terkait dengan fusi gamet masih menjadi misteri yang menggiurkan.Molekul rekombinan SPACA6 yang kami cirikan dan strukturnya yang terselesaikan akan memberikan wawasan tentang hubungan antara struktur bersama ini dan perannya dalam perlekatan dan fusi gamet.
Urutan DNA yang sesuai dengan prediksi ektodomain SPACA6 manusia (nomor akses NCBI NP_001303901.1; residu 27–246) dioptimalkan kodon untuk ekspresi dalam sel Drosophila melanogaster S2 dan disintesis sebagai fragmen gen dengan urutan pengkodean Kozak (Eurofins Genomics)., sinyal sekresi BiP dan ujung 5′ dan 3′ yang sesuai untuk kloning gen ini yang tidak bergantung pada ligasi menjadi vektor ekspresi pMT berdasarkan promotor metallothionein yang dimodifikasi untuk seleksi dengan puromisin (pMT-puro).Vektor pMT-puro mengkodekan situs pembelahan trombin diikuti oleh tag terminal C 10x-His (Gambar S2).
Transfeksi stabil dari vektor pMT-puro SPACA6 ke dalam sel D. melanogaster S2 (Gibco) dilakukan serupa dengan protokol yang digunakan untuk IZUMO1 dan JUNO43.Sel S2 dicairkan dan ditumbuhkan dalam medium Schneider (Gibco) yang ditambah dengan konsentrasi akhir 10% (v/v) serum anak sapi janin yang dilemahkan dengan panas (Gibco) dan 1X antibiotik antimikotik (Gibco).Sel bagian awal (3,0 x 106 sel) disepuh dalam masing-masing sumur pelat 6 sumur (Corning).Setelah 24 jam inkubasi pada suhu 27°C, sel ditransfeksi dengan campuran 2 mg vektor SPACA6 pMT-puro dan reagen transfeksi Effectene (Qiagen) sesuai dengan protokol pabrikan.Sel yang ditransfusikan diinkubasi selama 72 jam dan kemudian dipanen dengan puromisin 6 mg/ml.Sel kemudian diisolasi dari medium Schneider lengkap dan ditempatkan dalam medium bebas serum Insect-XPRESS (Lonza) untuk produksi protein skala besar.Batch 1 L kultur sel S2 ditumbuhkan menjadi 8–10 × 10 ml-1 sel dalam labu Erlenmeyer polipropilen beralas datar berventilasi 2 L dan kemudian disterilkan dengan konsentrasi akhir 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) dan disaring secara steril.diinduksi.Kultur yang diinduksi diinkubasi pada suhu 27°C dengan kecepatan 120 rpm selama empat hari.
Media terkondisi yang mengandung SPACA6 diisolasi dengan sentrifugasi pada 5660×g pada suhu 4°C diikuti oleh sistem filtrasi aliran tangensial Centramate (Pall Corp) dengan membran MWCO 10 kDa.Oleskan media pekat yang mengandung SPACA6 ke dalam kolom resin agarosa Ni-NTA (Qiagen) 2 ml.Resin Ni-NTA dicuci dengan 10 volume kolom (CV) buffer A dan kemudian 1 CV buffer A ditambahkan untuk menghasilkan konsentrasi imidazol akhir 50 mM.SPACA6 dielusi dengan 10 ml buffer A yang ditambah dengan imidazol hingga konsentrasi akhir 500 mM.Trombin kelas restriksi (Millipore Sigma) ditambahkan langsung ke tabung dialisis (MWCO 12-14 kDa) pada 1 unit per mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 dan 150 mM NaCl (buffer B) untuk dialisis.) pada suhu 4°C selama 48 jam.SPACA6 yang dibelah trombin kemudian diencerkan tiga kali lipat untuk mengurangi konsentrasi garam dan dimasukkan ke dalam kolom penukar kation MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) 1 ml yang diseimbangkan dengan 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Penukar kation dicuci dengan 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, kemudian SPACA6 dielusi dengan gradien linier 0 hingga 500 mM NaCl dalam 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 untuk 25 CV.Setelah kromatografi penukar ion, SPACA6 dipekatkan menjadi 1 ml dan dielusi secara isokratis dari kolom ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) yang diseimbangkan dengan buffer B. Menurut kromatogram, fraksi kumpulan dan konsentrat yang mengandung SPACA6.Kemurnian dikendalikan oleh elektroforesis bernoda Coomassie pada gel SDS-poliakrilamida 16%.Konsentrasi protein diukur dengan absorbansi pada 280 nm menggunakan hukum Beer-Lambert dan koefisien kepunahan molar teoritis.
SPACA6 yang dimurnikan didialisis semalaman terhadap 10 mM natrium fosfat, pH 7,4 dan 150 mM NaF dan diencerkan hingga 0,16 mg/mL sebelum dianalisis dengan spektroskopi CD.Pemindaian spektral CD dengan panjang gelombang 185 hingga 260 nm dikumpulkan pada spektropolarisasi Jasco J-1500 menggunakan kuvet kuarsa dengan panjang jalur optik (Helma) 1 mm pada 25°C dengan kecepatan 50 nm/menit.Spektrum CD dikoreksi pada awal, dirata-ratakan pada 10 akuisisi, dan dikonversi ke mean residual elliptisitas (θMRE) dalam derajat cm2/dmol:
dimana MW adalah berat molekul setiap sampel dalam Da;N adalah jumlah asam amino;θ adalah eliptisitas dalam miliderajat;d sesuai dengan panjang jalur optik dalam cm;konsentrasi protein dalam satuan.